沉默Musashi1基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性及放療敏感性的影響.pdf

1、結(jié)腸癌是全球范圍內(nèi)消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國僅次于胃癌和食道癌，位居第三，且近年來發(fā)病率持續(xù)升高，預(yù)后差。有關(guān)其發(fā)病機(jī)制及防治措施的研究是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。
　　結(jié)腸癌的發(fā)生是在不同遺傳背景下由致癌基因的激活和抑癌基因的失活共同作用的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是基因表達(dá)的關(guān)鍵部分，這一過程主要受RNA結(jié)合蛋白（RNA-Binding Proteins，RBPs）的調(diào)節(jié)。業(yè)已證實(shí)，人體基因組中包含有800多種RBPs

2、，其中的幾種被發(fā)現(xiàn)控制著與癌變過程相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)。對(duì)RBPs深入的研究逐步揭示，它們與轉(zhuǎn)錄因子類似，具有抑癌和促癌作用。
　　Musashi1（Msi1）作為一種進(jìn)化保守的RNA結(jié)合蛋白家族成員，對(duì)于維持自我更新與分化之間的平衡具有重要作用。眾多研究表明， Msi1可作為一種致癌基因，也是多種腫瘤干細(xì)胞和(或)祖細(xì)胞的重要標(biāo)記物，能刺激腫瘤干、祖細(xì)胞的形成和發(fā)展。過度表達(dá)Msi1的腸上皮祖細(xì)胞可通過激活Wnt、Notch信號(hào)通路及

3、調(diào)節(jié)p21這三個(gè)作用靶點(diǎn)，使細(xì)胞增殖旺盛，促進(jìn)祖細(xì)胞的致瘤性，增加移植瘤的致瘤性。一般認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞對(duì)放化療抗拒，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源。Msi1可能通過促進(jìn)β-鏈蛋白（β-catenin）的核內(nèi)聚，增加結(jié)腸癌放療的不敏感性，促進(jìn)侵襲性腫瘤發(fā)展。此外Msi1位于多個(gè)信號(hào)通路的交匯點(diǎn)，是細(xì)胞基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，在細(xì)胞發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。同時(shí)， Msi1也可作為多種癌變的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Msi1

4、有望成為防治癌癥的一個(gè)分子靶點(diǎn)。
　　因此，確定Msi1在結(jié)腸癌中的作用及其機(jī)制具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。但目前有關(guān)Msi1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討Msi1在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制，以及對(duì)放療敏感性的影響。本課題研究將分四部分進(jìn)行。1.首先在結(jié)腸癌患者的癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞系證實(shí) Msi1的高表達(dá)，通過 RNA干擾技術(shù)構(gòu)建沉默Msi1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系；2.探討沉默Msi1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性

5、的影響；3.探討沉默Msi1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長影響的分子機(jī)制；4.探討沉默Msi1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞放療敏感性的影響。
　　第一部分結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中Musashi1蛋白表達(dá)及Musashi1穩(wěn)定低表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞系構(gòu)建
　　目的：檢測Musashi1在結(jié)腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞系的表達(dá)水平；構(gòu)建Msi1穩(wěn)定低表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞系。
　　方法：采用Western blot方法檢測結(jié)腸癌患者癌組織、癌周正常組織、以及HCT116、SW48

6、0和SW620三種結(jié)腸癌細(xì)胞系中Msi1的蛋白表達(dá)，挑選 Msi1表達(dá)水平最高的結(jié)腸癌細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)研究。應(yīng)用 RNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)沉默Msi1的基因序列及陰性對(duì)照序列，通過與質(zhì)粒連接后感染工具細(xì)胞，將干擾質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒植入慢病毒載體，隨后感染結(jié)腸癌細(xì)胞；經(jīng)過抗生素篩選獲得穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞株，并運(yùn)用Real-time PCR及Western blot的方法從RNA水平和蛋白水平檢測空白組（Blank）、陰性對(duì)照組（negative co

7、ntrol，NC）和敲低組（knock down，KD）HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞基因沉默的效果。
　　結(jié)果：通過Western blot方法檢測，發(fā)現(xiàn)與正常腸粘膜相比，結(jié)腸癌組織及三種結(jié)腸癌細(xì)胞株中 Msi1蛋白均特異性高表達(dá)；在 HCT116、SW480、SW620三種結(jié)腸癌細(xì)胞株中，HCT116細(xì)胞Msi1蛋白的表達(dá)量最高，因此選取HCT116細(xì)胞作為后續(xù)研究的目的細(xì)胞。本研究中，成功構(gòu)建了帶有干擾Msi1基因序列GV248-M

8、si1-shRNA的慢病毒及陰性對(duì)照慢病毒 GV248-NC-shRNA，將干擾慢病毒及陰性對(duì)照慢病毒感染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，利用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定的表達(dá)株。同時(shí) Real-time PCR和 Western blot結(jié)果顯示，感染 Msi1干擾慢病毒載體后結(jié)腸癌 HCT116細(xì)胞Msi1在RNA水平和蛋白水平分別下降了73.85％和59.01%。
　　小結(jié)：結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞株中Msi1蛋白均特異性高表達(dá)。利用結(jié)腸癌HC

9、T116細(xì)胞株可成功構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)Msi1細(xì)胞系。
　　第二部分沉默Musashi1對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　目的：探討沉默Musashi1對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　方法：利用構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)Msi1的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，應(yīng)用MTS法檢測沉默Msi1后結(jié)腸癌細(xì)胞增殖情況，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡的變化，Transwell小室檢測其體外侵襲能力，腫瘤球?qū)嶒?yàn)檢測腫瘤細(xì)胞干

10、性。并通過建立裸鼠移植瘤模型，觀察沉默Msi1對(duì)裸鼠成瘤的影響。
　　結(jié)果：MTS法及Transwell小室檢測結(jié)果顯示，沉默Msi1后，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞體外增殖及侵襲能力顯著下降。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，沉默Msi1后腫瘤細(xì)胞的凋亡明顯增加，G0/G1期細(xì)胞增多。腫瘤球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，沉默Msi1可明顯降低腫瘤球形成的數(shù)量。結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤結(jié)果顯示，降低Msi1表達(dá)可明顯抑制移植瘤的生長。
　　小結(jié)：

11、沉默Msi1能抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞體外增殖能力和侵襲能力，導(dǎo)致細(xì)胞G0/G1期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。沉默Msi1可明顯降低結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的干性，抑制移植瘤的生長。
　　第三部分沉默Musashi1對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生長抑制的分子機(jī)制
　　目的：探討沉默Musashi1抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生長的分子機(jī)制。
　　方法：利用Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測沉默Msi1基因后

12、
　　細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物 p21（抑癌基因） mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并構(gòu)建p213?-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體（p21WT）及其突變體（p21MU），將報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染沉默Msi1的細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞株，計(jì)算 Msi1敲低組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的熒光比值，并進(jìn)行比較以判斷 p213?-UTR區(qū)活性。
　　結(jié)果：Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，與空白組及陰性對(duì)照組相比較，沉默Msi1后結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的p

13、21蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；Real-time PCR結(jié)果顯示，3組細(xì)胞p21 mRNA水平的表達(dá)未見明顯變化。進(jìn)一步熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組、陰性對(duì)照組相比，敲低組p21WT的熒光素酶活性明顯上升，Msi1反應(yīng)位點(diǎn)突變體p21MU的熒光素酶活性則沒有明顯變化。
　　小結(jié)：結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中，Msi1能夠與其靶基因p21 mRNA的3?-UTR區(qū)特異性的結(jié)合，并抑制其翻譯，下調(diào)p21蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。沉默M

14、si1后可通過上調(diào)p21蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤生長作用。
　　第四部分沉默Musashi1對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞放療敏感性的影響
　　目的：探討沉默Musashi1對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞放療敏感性的影響。
　　方法：采用慢病毒介導(dǎo)的Msi1干擾表達(dá)質(zhì)粒感染HCT116細(xì)胞；對(duì)感染的HCT116細(xì)胞進(jìn)行X線照射；運(yùn)用克隆實(shí)驗(yàn)檢測沉默Msi1基因?qū)CT116細(xì)胞放射敏感性的影響。通過 MTS法檢測照射后結(jié)腸癌細(xì)胞增

15、殖情況，并計(jì)算其抑制率。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測照射后細(xì)胞周期及凋亡的變化。
　　結(jié)果：克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)0~8Gy X線照射后，敲低組細(xì)胞存活曲線下降，D0、Dq、N和 SF2值均明顯低于空白組和陰性對(duì)照組，相對(duì)于空白組和陰性對(duì)照組放射增敏比SER分別為1.56和1.47。MTS試驗(yàn)結(jié)果顯示，各時(shí)間段敲低組細(xì)胞的增殖活性均顯著低于空白組和陰性對(duì)照組，而且隨著時(shí)間和劑量的增加，各組抑制率逐漸增加。進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)顯示，照射后各組細(xì)胞凋

16、亡率明顯增加，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，隨著時(shí)間延長，凋亡率逐漸增加。敲低組凋亡比例在各時(shí)間點(diǎn)增加的程度更加明顯。并且照射后敲低組細(xì)胞G2/M期比例較空白組和陰性對(duì)照組顯著下降。
　　小結(jié)：抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞Msi1基因表達(dá)具有放療增敏作用，其增敏機(jī)制可能是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡，解除放療后細(xì)胞G2/M期阻滯，從而增加結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的放療敏感性。
　　結(jié)論:
　　1結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞株中 Msi1蛋白均特異性高表

17、達(dá)，提示Msi1可能在結(jié)腸癌發(fā)生與發(fā)展中起重要作用；
　　2利用結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞可成功構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)Msi1的細(xì)胞株；
　　3沉默Msi1可抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖和侵襲能力，導(dǎo)致細(xì)胞G0/G1期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞干性，抑制移植瘤的生長；
　　4沉默Msi1可上調(diào)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞Msi1的靶基因p21蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用；
　　5沉默Msi1可通過促進(jìn)結(jié)腸癌HCT116細(xì)