上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI獲得耐藥后放射敏感性中的作用.pdf

1、研究目的：
　　表皮生長因子-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)開啟了非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)個體化治療時代，已經(jīng)成為EGFR突變陽性的晚期NSCLC一線標(biāo)準(zhǔn)治療。然而不可避免地是，在EGFR-TKI治療NSCLC的過程中均出現(xiàn)獲得性耐藥。EGFR-TKI獲得性耐藥后NSCLC的治療策略選擇尤為重要。放射治療作為EGFR-TKI獲得性耐藥后NSCLC的局部治療重要選擇之一，在后續(xù)治療中發(fā)揮著重要作用。有臨床研究表明：放療作為E

2、GFR-TKI耐藥后NSCLC的治療策略能延長患者的生存時間。但放療抗拒是制約放療療效的重要原因。EGFR-TKI獲得性耐藥后NSCLC對放療敏感性如何？目前針對EGFR-TKI獲得性耐藥后NSCLC放療療效的預(yù)測尚缺乏有效相關(guān)指標(biāo)。既往研究顯示，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是EGFR-TKI獲得性耐藥的重要機制之一，在臨床研究發(fā)現(xiàn)EMT陽性患者放化療效果差，而基礎(chǔ)研究表明EMT不僅與腫瘤的侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，還與腫瘤放療抗拒密切相關(guān)。為此，我

3、們提出科學(xué)假設(shè)：EMT狀態(tài)對NSCLC獲得性耐藥后放射敏感性存在影響，可能是EGFR-TKI獲得性耐藥后預(yù)測放療敏感性的有效指標(biāo)。
　　研究方法：
　　本研究選用EGFR19外顯子缺失突變的人肺腺癌細(xì)胞PC-9及對吉非替尼產(chǎn)生獲得性耐藥的PC-9/AB細(xì)胞株。按以下方法進行實驗研究：
　　1、采用PCR技術(shù)檢測PC-9和PC-9/AB細(xì)胞EGFR基因突變情況，F(xiàn)ISH法檢測c-Met基因擴增情況;用細(xì)胞增殖/毒性實驗（

4、CCK8法）檢測兩組細(xì)胞對吉非替尼的敏感性;
　　2、比較PC-9和PC-9/AB細(xì)胞的放射敏感性：采用CCK8法檢測不同劑量X射線照射之后兩組細(xì)胞的相對細(xì)胞存活數(shù)、平板克隆實驗檢測不同劑量X射線照射之后其克隆成形能力，以及流式細(xì)胞術(shù)檢測4Gy劑量X射線照射之后細(xì)胞凋亡情況，對比兩組細(xì)胞對X射線的敏感性;
　　3、采用免疫印跡法(Western Blotting)檢測兩組細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vement

5、in和EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail等表達(dá)水平，同時觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，確定細(xì)胞株的EMT狀態(tài);再通過劃痕愈合實驗檢測兩組細(xì)胞的遷移能力;初步探討伴EMT的獲得性耐藥是否影響其放射敏感性的原因;
　　4、通過TGF-β1誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞后獲得PC-9/TGF細(xì)胞;檢測EGFR基因突變情況和c-Met基因擴增情況;Western Blot檢測發(fā)生EMT情況，以及劃痕愈合實驗檢測細(xì)胞遷移能力變化情況;CCK8法檢測對吉非替尼敏感性。再

6、比較PC-9、PC-9/TGF和PC-9/AB三組細(xì)胞的放射敏感性：采用CCK8法檢測不同劑量X射線照射之后三組細(xì)胞的相對細(xì)胞存活數(shù)、平板克隆實驗檢測不同劑量X射線照射之后克隆成形能力，以及流式細(xì)胞術(shù)檢測4Gy劑量X射線照射之后細(xì)胞凋亡情況，進行多重比較，來對比三組細(xì)胞對X射線的敏感性，從正方向驗證EMT與NSCLC細(xì)胞EGFR-TKI獲得性耐藥后放射敏感性相關(guān);
　　5、采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將PC-9/AB細(xì)胞轉(zhuǎn)染CDH1基因后獲

7、得PC-9/AB-CDH1細(xì)胞;檢測EGFR基因突變情況和c-Met基因擴增情況;Western Blot檢測逆轉(zhuǎn)EMT情況，以及劃痕愈合實驗檢測細(xì)胞遷移能力變化情況;CCK8法檢測對吉非替尼敏感性。再比較PC-9/AB細(xì)胞和PC-9/AB-CDH1細(xì)胞的放射敏感性：采用CCK8法檢測不同劑量X射線照射之后兩組細(xì)胞的相對細(xì)胞存活數(shù)、平板克隆實驗檢測不同劑量X射線照射之后其克隆成形能力，以及流式細(xì)胞術(shù)檢測4Gy劑量X射線照射之后細(xì)胞凋亡情

8、況，來對比兩組細(xì)胞對X射線的敏感性，從反方向驗證EMT在NSCLC細(xì)胞EGFR-TKI獲得性耐藥后放射敏感性的關(guān)系。
　　研究結(jié)果：
　　1、經(jīng)檢測PC-9和PC-9/AB細(xì)胞均為EGFR基因19外顯子突變，18、20、21外顯子無突變，無T790m突變，無c-Met擴增。對兩組細(xì)胞進行了吉非替尼的敏感性檢測，結(jié)果顯示：人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C-9/AB細(xì)胞對吉非替尼的敏感性明顯低于親本細(xì)胞株P(guān)C-9，IC50分別為9.68μmo

9、l/L和0.06μmol/L(P＜0.01);
　　2、獲得性耐藥的PC-9/AB細(xì)胞放射敏感性較PC-9顯著降低：隨著照射劑量的增加，PC-9和PC-9/AB細(xì)胞相對細(xì)胞存活數(shù)均逐漸減少。PC-9/AB細(xì)胞在4Gy、6Gy、8Gy、10Gy劑量組相對細(xì)胞存活數(shù)均明顯高于PC-9細(xì)胞(P＜0.05);PC-9/AB細(xì)胞在2Gy、4Gy、6Gy、8Gy劑量組克隆成形率高于PC-9(P＜0.05);在4Gy劑量照射下，PC-9/AB細(xì)

10、胞凋亡率低于PC-9，凋亡率分別為(14.80±1.06)％VS(30.52±2.76)％(P＜0.05);
　　3、與PC-9相比，PC-9/AB細(xì)胞出現(xiàn)EMT表型，表現(xiàn)為PC-9/AB細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞間連接變疏松，細(xì)胞出現(xiàn)梭形改變，即由上皮細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變;PC-9/AB上皮型標(biāo)記蛋白E-Cadherin表達(dá)減少，間葉型標(biāo)記蛋白Vimentin表達(dá)增加，與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)增加，PC-9

11、/AB細(xì)胞較PC-9劃痕愈合率明顯提高，24h愈合率從(33.47±1.38)％提高至(53.23±2.18)％，48h愈合率從(49.84±0.78)％提高至(83.88％±3.35)％，遷移能力明顯增強;
　　4、TGF-β1誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞株P(guān)C-9/TGF細(xì)胞基因檢測為EGFR基因19外顯子突變，18、20、21外顯子無突變，無T790m突變，無c-Met擴增。相對于PC-9細(xì)胞，PC-9/TGF細(xì)胞出現(xiàn)EMT表型，表現(xiàn)為P

12、C-9/TGF細(xì)胞間連接變疏松，細(xì)胞呈梭形，即由上皮細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，PC-9/TGF細(xì)胞的上皮型標(biāo)記蛋白E-Cadherin表達(dá)減少，間葉型標(biāo)記蛋白Vimentin表達(dá)增加，與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)增加;PC-9/TGF細(xì)胞較PC-9劃痕愈合率明顯提高，24h愈合率從(33.47±1.38)％提高至(51.05±1.34)％，48h愈合率從(49.84±0.78)％提高至(80.50±3.23)％，其遷移能力顯著增

13、強;PC-9/TGF細(xì)胞對吉非替尼的敏感性較PC-9顯著降低，IC50值為6.21μmol/L和0.06μmol/L(P＜0.01);
　　5、誘導(dǎo)出現(xiàn)EMT的PC-9/TGF細(xì)胞放射敏感性顯著降低：隨著照射劑量的增加，PC-9、PC-9/TGF以及PC-9/AB三組細(xì)胞的相對細(xì)胞存活數(shù)均逐漸減少。PC-9/TGF細(xì)胞在4Gy、6Gy、8Gy、10Gy劑量組相對細(xì)胞存活數(shù)與PC-9相比增加(P＜0.05);PC-9/TGF細(xì)胞克隆

14、成形率較PC-9增加(P＜0.05）;在4Gy劑量照射下，PC-9/TGF細(xì)胞較PC-9細(xì)胞凋亡減少，分別為(15.24±2.03)％VS(30.52±2.76)％(P＜0.05);而PC-9/TGF和PC-9/AB兩組細(xì)胞間相對細(xì)胞存活數(shù)、克隆成形率和凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）;
　　6、PC-9/AB轉(zhuǎn)染CDH1基因后獲得的PC-9/AB-CDH1細(xì)胞基因檢測為EGFR基因19外顯子突變，18、20、21外顯子無突

15、變，無T790m突變，無c-Met擴增。相對于PC-9/AB細(xì)胞，PC-9/AB-CDH1細(xì)胞逆轉(zhuǎn)了EMT，表現(xiàn)為其細(xì)胞間連接變緊密，細(xì)胞恢復(fù)類圓形，即由間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)向上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變;PC-9/AB-CDH1細(xì)胞的上皮型標(biāo)記蛋白E-Cadherin表達(dá)增加，間葉型標(biāo)記蛋白Vimentin表達(dá)減少，與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)減少;PC-9/AB-CDH1細(xì)胞較PC-9/AB細(xì)胞劃痕愈合率下降，24h愈合率從(53.23±2.18

16、)％下降至(37.16±4.15)％，48h愈合率從(83.88％±3.35)％下降至(49.32±3.12)％，其遷移能力減低;PC-9/AB-CDH1細(xì)胞對吉非替尼的敏感性明顯高于PC-9/AB細(xì)胞，IC50值為分別為1.25μmol/L和9.68μmol/L(P＜0.01）;
　　7、逆轉(zhuǎn)EMT后PC-9/AB-CDH1細(xì)胞放射敏感性較PC-9/AB細(xì)胞顯著增加：隨著照射劑量的增加，兩組細(xì)胞相對細(xì)胞存活數(shù)均逐漸減少。PC-9

17、/AB-CDH1細(xì)胞在4Gy、6Gy、8Gy、10Gy劑量組細(xì)胞相對存活數(shù)較PC-9/AB細(xì)胞減少(P＜0.05);PC-9/AB-CDH1細(xì)胞在2Gy、4Gy、6Gy、8Gy劑量組克隆成形率較PC-9/AB細(xì)胞減少(P＜0.05);在4Gy劑量照射下，PC-9/AB-CDH1細(xì)胞較PC-9/AB細(xì)胞凋亡增多，凋亡率為(33.85±2.10)％VS(14.80±1.06)％(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)：

18、伴有EMT的對吉非替尼獲得耐藥EGFR突變型NSCLC細(xì)胞PC-9/AB發(fā)生了放射抵抗，與其親本細(xì)胞PC-9相比放射敏感性顯著下降，PC-9經(jīng)TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生EMT后，其放射敏感性下降;而逆轉(zhuǎn)PC-9/AB的EMT在恢復(fù)對吉非替尼敏感性的同時也增強了放射敏感性。提示EMT在NSCLC細(xì)胞EGFR-TKI繼發(fā)性耐藥后放射敏感性中有重要影響，EMT與NSCLC EGFR-TKI獲得耐藥后發(fā)生放射敏感性下降相關(guān)，可能作為EGFR-TKI獲得