紫草素誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE2-DDP細(xì)胞壞死樣凋亡克服其耐藥性的研究.pdf

1、[目的]
　　 探討紫草素對(duì)人鼻咽癌耐藥細(xì)胞株CNE2/DDP細(xì)胞的毒性作用及作用機(jī)理。
　　 [方法]
　　 (1)體外培養(yǎng)人鼻咽癌藥敏細(xì)胞株CNE2細(xì)胞、耐藥細(xì)胞株CNE2/DDP細(xì)胞和正常人胚鼻咽上皮細(xì)胞HENE細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究；
　　 (2)四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測(cè)順鉑(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫草素對(duì)HENE、CNE2、CNE2/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃

2、度(IC50)，分析各自的耐藥倍數(shù)(RF)；
　　 (3)通過流式細(xì)胞術(shù)分別對(duì)不同處理后的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：不同濃度紫草素處理CNE2、CNE2/DDP細(xì)胞不同時(shí)間后，細(xì)胞膜的破損情況；20μmol/L紫草素、20μmol/L紫草素+60μmol/L Nec-1(壞死樣凋亡特異性抑制劑Necrostatin-l的縮寫；Necrostatin-li是其失活形式，縮寫為Nec-li)分別處理CNE2細(xì)胞24h后，與空白對(duì)照組比較

3、線粒體膜電位的變化情況；不同抑制劑(Nec-l、Nec-li和Caspase總抑制劑z-VAD-fmk)抑制細(xì)胞死亡情況；20μmol/L紫草素處理不同細(xì)胞6h、24h后，Annexin V-PI雙染觀察細(xì)胞死亡情況；
　　 (4)通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)紫草素、DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中是否出現(xiàn)DNA梯帶現(xiàn)象；分光光度法檢測(cè)紫草素、DDP處理不同細(xì)胞后，Caspase-3激活情況。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)CN

4、E2/DDP細(xì)胞對(duì)DDP、5-FU的耐藥倍數(shù)分別是10.62、26.64倍，確定CNE2/DDP細(xì)胞具有多藥耐藥性。紫草素對(duì)CNE2、CNE2/DDP細(xì)胞均具有良好細(xì)胞毒性作用，呈時(shí)間、濃度依賴性，CNE2/DDP細(xì)胞對(duì)其耐藥倍數(shù)為1.08倍。紫草素對(duì)HENE細(xì)胞增殖的抑制作用較弱。
　　 (2)以不同濃度的紫草素作用于CNE2、CNE2/DDP細(xì)胞不同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度或處理時(shí)間的增長，細(xì)胞膜破損的比例(PI陽性細(xì)胞)也

5、不斷增大。細(xì)胞膜破損先于PS蛋白外翻出現(xiàn)：20μmol/L紫草素分別作用CNE2、CNE2/DDP6h、24h后發(fā)現(xiàn)，AV+PI-的細(xì)胞比例沒有明顯增加，AV-PI+的細(xì)胞比例均明顯減少，AV+PI+的細(xì)胞比例急劇增加。
　　 (3)20μmol/L紫草素+50μmol/Lz-VAD-fmk處理CNE2、CNE2/DDP細(xì)胞24h后，細(xì)胞死亡率與20μmol/L紫草素組細(xì)胞死亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；20μmo

6、l/L紫草素+60μmol/L Nec-1組細(xì)胞死亡率與20μmol/L紫草素組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；20μmol/L紫草素+60μmol/L Nec-li組細(xì)胞死亡率與20μmol/L紫草素組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 (4)20μmol/L紫草素處理CNE2、CNE2/DDP細(xì)胞24h后，其Caspase-3活性增長倍數(shù)與20μmol/L DDP處理組Caspase-3活性增長倍數(shù)比較，

7、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 (5)20μmol/L紫草素處理CNE2、CNE2/DDP細(xì)胞24h后均未檢測(cè)到明顯的DNA梯帶現(xiàn)象，而20μmol/L DDP處理CNE2、CNE2/DDP細(xì)胞24h后均可見明顯DNA梯帶現(xiàn)象。
　　 (6)20μmol/L紫草素處理CNE2細(xì)胞24h后，線粒體膜電位檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，紅綠熒光百分率之比與空白對(duì)照組比較明顯下降(P<0.01)，20μmol/L紫草素+50μmol/L