AcAPc2蛋白的純化及其抗腫瘤作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、犬鉤蟲抗凝血肽 c2(Ancylostoma caninum anticoagulantpeptide c2，AcAPc2)是從吸血寄生蟲——犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)中分離出來(lái)的一種具有抑制組織因子-VⅡa復(fù)合物(fVⅡ a/TF)的蛋白。它通過(guò)結(jié)合于fXa的催化活性中心以外的部位而進(jìn)一步特異性抑制fVⅡa/TF復(fù)合物。由于fVⅡ a/TF復(fù)合物在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，因此AcAPc2可有效地抑制凝血。AcA

2、Pc2首先是由Stanssens等利用分子克隆技術(shù)分離出來(lái)的，它由84個(gè)氨基酸組成。盡管已有報(bào)道表明AcAPc2己實(shí)現(xiàn)了在E coli和酵母中表達(dá)，然而該重組蛋白與天然的AcAPc2氨基酸序列存在一定的差異，這在一定程度上會(huì)影響目的蛋白的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白的功能。到目前為止，利用基因工程的方法表達(dá)與天然AcAPc2氨基酸序列相同的AcAPc2(r AcAPc2)尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。 蛋白質(zhì)剪接(protein splicing)是

3、在蛋白質(zhì)內(nèi)含肽(intein)的自我催化作用下從翻譯后的蛋白質(zhì)前體中切除蛋白質(zhì)內(nèi)含肽，同時(shí)兩側(cè)的蛋白質(zhì)外顯肽(extein)通過(guò)連接反應(yīng)形成一個(gè)新的具有生物活性的蛋白質(zhì)。intein對(duì)于蛋白質(zhì)工程來(lái)說(shuō)是一個(gè)功能強(qiáng)大的工具。Intein與ex-tein幾乎沒(méi)有序列同源性，天然的extein常?？梢蕴鎿Q成外源的蛋白質(zhì)而不影響intein的剪切活性。這一點(diǎn)是以intein作為融合蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)純化的理論基礎(chǔ)。IMPACT<'TM>-TWIN系

4、統(tǒng)利用intein的自剪切實(shí)現(xiàn)了蛋白的純化。利用這一系統(tǒng)可以得到與天然蛋白序列一致的重組蛋白質(zhì)。本研究利用pTWIN1表達(dá)載體，根據(jù)AcAPc2蛋白的氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，利用引物搭橋PCR的方法合成AcAPc2的全長(zhǎng)cDNA序列，成功構(gòu)建了AcAPc2原核表達(dá)載體pTWIN1-AcAPc2，實(shí)現(xiàn)了AcAPc2在大腸桿菌中的高效表達(dá)。利用pTWIN1載體的SSP dnaB intein的自剪切和CBD與幾丁質(zhì)的緊密結(jié)合，獲得了具有抗凝活性

5、的、與天然AcAPc2蛋白氨基酸序列一致的rAcAPc2蛋白。絲氨酸蛋白酶參與體內(nèi)各種生命活動(dòng)的調(diào)控，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)許多重要的生命過(guò)程。研究表明某些絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，并且可以誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞的凋亡。作為絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員之一，AcAPC2可能會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用。 本研究通過(guò)SRB染色法發(fā)現(xiàn)，rAcAPc2蛋白能劑量依賴性地抑制人肺癌細(xì)胞NCI—H460的體外增殖。在rAcAPc2濃度

6、達(dá)到100μg/ml時(shí)，NCI-H460細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到69％。隨后的DAPI染色、TUNEL和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明。rAcAPc2能夠誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞發(fā)生凋亡。有資料顯示uPA/uPAR在惡性腫瘤組織中的表達(dá)水平高于正常組織和良性腫瘤，其表達(dá)水平與患者的預(yù)后有關(guān)。因此，uPA/uPAR系統(tǒng)被認(rèn)為在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用。2006年，Subramanian et al．報(bào)道uPA/uPAR轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)可以

7、直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡<'[26]>。有鑒于此，我們采用RT-PCR的方法，檢測(cè)經(jīng)rAcAPc2蛋白處理的NCI-H460細(xì)胞 (rAcAPc2<'+>)的尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase—type plasminogen activator，uPA)和尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR)的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示：隨著rAcAPc2劑量

8、的增高，NCI—H460細(xì)胞uPA和uPAR的mRNA表達(dá)水平隨之降低。已經(jīng)證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)uPA蛋白合成增加主要是由基因轉(zhuǎn)錄水平引起的，轉(zhuǎn)錄因子NF-kB在uPA和uPAR基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用，它可以增加uPA和uPAR的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。NF-kB參與腫瘤細(xì)胞的增殖和抗凋亡作用過(guò)程，這是以NF-kB的活化為前提的?；罨腘F-kB可以上調(diào)一系列抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。NF-kB的活化依賴于26S

9、蛋白酶體的識(shí)別及其對(duì)IkBα蛋白的水解。為了進(jìn)一步研究rAcAPc2蛋白誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們采用Western blot方法，使用NF-kB、IkBα多克隆抗體分別對(duì)rAcAPc2處理組和非處理組的細(xì)胞核蛋白和胞質(zhì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示隨著rAcAPc2劑量的增高，NCI-H460細(xì)胞核中NF-kB蛋白量隨之降低而胞質(zhì)中IkBα蛋白量則隨之升高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證rAcAPc2是否影響NF-kB的活化，我們采用免疫組化和

10、免疫熒光的方法檢測(cè)NF-kB在細(xì)胞中的分布情況，結(jié)果表明隨著rAcAPc2劑量的增高，NCI-H460細(xì)胞核中NF-kB蛋白水平隨之降低。隨后的EMSA法對(duì)核蛋白的測(cè)定結(jié)果顯示對(duì)照組中NF-kappa B結(jié)合活性較強(qiáng)，而rAcAPc2處理組中隨著rAcAPc2劑量的增加，NF-kappa B結(jié)合活性呈降低趨勢(shì)。我們還檢測(cè)了NCI-H460細(xì)胞26S蛋白酶體在不同濃度rAcAPc2作用下的胰蛋白酶活性，結(jié)果顯示25μg/ml rAcAPc

11、2即可抑制細(xì)胞26S蛋白酶體的胰蛋白酶活性，且隨著rAcAPc2劑量的增加，細(xì)胞26S蛋白酶體的胰蛋白酶活性顯著降低。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rAcAPC2蛋白通過(guò)抑制26S蛋白酶體活性抑制了IkBα蛋白的降解，進(jìn)而抑制了NF-kB的活化。以上結(jié)果顯示通過(guò)簡(jiǎn)單的蛋白表達(dá)純化系統(tǒng)，可以得到高表達(dá)的rAcAPc2-CBD—intein融合蛋白。利用pH-依賴型的Ssp dnaB intein的剪切，可以直接純化出純度為98％rAcAPc2。重要

12、的是，rAcAPc2具有延長(zhǎng)血漿凝血酶原時(shí)間和活化的部分凝血活酶時(shí)間及抑制胰蛋白酶活性的功能，而且這種抗凝活性和抑制胰蛋白酶活性是呈劑量效應(yīng)的。高純度、高活性的rAcAPc2的獲得，不僅為AcAPc2蛋白的功能研究提供研究對(duì)象，而且為血栓相關(guān)疾病的治療提供新的藥物。進(jìn)一步的研究表明rAcAPc2蛋白可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能是rAcAPc2蛋白通過(guò)抑制26S蛋白酶體活性抑制了IkBα的降解，從而抑制NF-kB的活