CAI抗腫瘤作用機制及聯(lián)合用藥的初步研究.pdf

1、肺癌是當今世界上癌癥相關死因中發(fā)生率最高的癌癥種類之一，因此尋找有效的、不良反應小的、作用明確以及聯(lián)合用藥治療策略是醫(yī)藥界研究的熱點課題。羧胺三唑(Carboxyamidotriazole，CAI)是本課題組多年來研究的一種毒副作用很低的非細胞毒類新型抗癌藥，其對體內/外多種腫瘤模型有良好的抑制作用，但是CAI在人體臨床試驗中表現(xiàn)的抗腫瘤作用較溫和。
　　目的：
　　為了增強CAI的藥物治療效果以及探索CAI的作用及作用機理

2、，開展了三部分的研究:(1)評估CAI與索拉非尼(S orafenib)協(xié)同抗腫瘤作用，并探討其可能的機制;(2)探索CAI在惡病質小鼠中起到的保護性作用;(3)探尋CAI在腫瘤細胞提升磷酸化乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）作用的上游機制。
　　索拉非尼是一種口服的多激酶抑制劑，可通過抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，抑制惡性腫瘤細胞的增殖。同時可通過抑制PDGF和VEGF受體酪氨酸激酶的活性，

3、而抑制內皮細胞的增殖。索拉非尼可以延長非小細胞肺癌患者的無進展生存期，但是總體療效有限。本部分研究探索CAI與索拉非尼在非小細胞肺癌中的協(xié)同治療作用以及其發(fā)揮協(xié)同作用可能的機制，旨在為非小細胞肺癌的臨床治療提供新的方案并提供理論依據(jù)。
　　此外伴隨癌癥產生的癌性惡病質是一種以全身性系統(tǒng)性炎癥反應為特征的紊亂綜合癥，它的發(fā)生不僅對患者的生活質量造成嚴重的不良影響，還可以使患者對化療藥物反應度降低并最終降低生存率。CAI除了具有抗癌特

4、性之外其在多種疾病模型中均體現(xiàn)出良好的抗炎作用。基于CAI的這種抗炎特性，同時在此探討CAI對腫瘤進展中出現(xiàn)的肌肉萎縮現(xiàn)象是否具有保護與治療作用。
　　在本研究中發(fā)現(xiàn)CAI對乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）有抑制作用，為了更深入的探討CAI抗腫瘤作用的具體分子機制，在此對于引起ACC抑制的上游信號通路進行探討。
　　方法：
　　用SRB法檢測CAI和/或索拉非尼在三株非小細胞肺癌

5、細胞株中的增殖抑制作用，并計算聯(lián)合用藥指數(shù)，并計算CAI對LLC細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。用AnnexinⅤ/PI對細胞進行染色，并用流式細胞術的方法檢測細胞凋亡比例。用DCFH-DA對細胞內活性氧進行染色并分別用熒光顯微鏡與流式細胞術的方法進行定性與定量分析。用MitoSox對線粒體特異的超氧化物進行染色并用流式細胞術檢測。NANOG的mRNA和蛋白表達水平分別用熒光定量PCR和western blot進行分析。堿性成纖維生長因

6、子(bFGF)作為NANOG的刺激劑，在LLC和A549細胞中與藥物共孵育來考察NANOG在CAI和索拉非尼引起活性氧積累中的作用。使用GSH(ROS的清除劑)或bFGF與藥物共孵育并用流式細胞術的方法對細胞凋亡比例進行檢測。建立荷瘤小鼠模型，并評價CAI與索拉非尼在體內的抑制腫瘤的作用。
　　建立晚期肺癌移植瘤模型，評估CAI對小鼠去瘤體重的保護作用。使用Western blot和逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）對給藥29

7、天后對其腓腸肌中的蛋白和mRNA表達水平的變化進行檢測。用ELISA的方法檢測血清中促炎細胞因子IL-6和TNF-α的水平。CAI在體外對SIRT1的直接激活作用通過熒光定量的方法進行測定。
　　用western blot方法檢測CAI對磷酸化ACC水平的影響，并通過使用鈣凋蛋白依賴性蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)阻滯劑STO609、具有肝激酶B1(Liver kinase B1，LKB1)突變的A549細胞、SIRT1抑制劑Ex

8、527和煙酰胺以及PKA抑制劑H-89與CAI共孵育，再檢測磷酸化ACC的水平來判斷上游信號通路對磷酸化ACC的影響。
　　結果：
　　1.在非小細胞肺癌株(LLC、A549和NCI-H1975)中CAI與索拉非尼協(xié)同抑制細胞增殖。
　　2.CAI與索拉非尼聯(lián)合使用可以提升細胞凋亡水平以及上調cleaved-caspase3和cleaved-PARP的水平。同時使用Z-VAD-FMK(pan-caspase抑制劑)與藥

9、物共孵育可以減少藥物引起的細胞凋亡水平。
　　3.CAI與索拉非尼合用可以誘導細胞內活性氧的積累，同時也提升線粒體特異的超氧化物的產生。
　　4.CAI與索拉非尼合用可降低細胞中NANOG的mRNA與蛋白表達水平。在細胞中使用bFGF，可同時刺激細胞內NANOG的表達以及刺激細胞增殖。
　　5.將bFGF與藥物共孵育，可以減輕藥物誘導的活性氧的產生。
　　6.將GSH（活性氧清除劑）或bFGF與藥物進行共孵育，可

10、以減緩藥物引發(fā)的細胞凋亡比例。
　　7.在體內試驗中，CAI與索拉非尼(10mgkg-1)合用可以顯著的抑制腫瘤的生長，這種抑制能力與索拉非尼高劑量單用組(30mg kg-1)相當。同時CAI和索拉非尼合用組與索拉非尼高劑量組比較，前者的小鼠去瘤體重更重。
　　8.CAI和索拉非尼合用可以降低小鼠腫瘤組織中的NANOG的蛋白含量，并且可以提升腫瘤組織中的脂質過氧化水平。
　　9.在癌性惡病質模型鼠中，從接種腫瘤細胞后第

11、19天開始，CAI給藥組小鼠的去瘤體重與溶劑對照組比表現(xiàn)出顯著升高。實驗結束時，CAI組小鼠的腓腸肌與附睪脂肪組織的重量比溶劑對照組有顯著性的增加。
　　10.在腓腸肌組織中CAI通過抑制與蛋白水解相關的FoxO3轉錄因子的表達以及泛素連接酶E3（MuRF1和atrogin1）的表達來抑制肌肉組織的消耗。同時在肌肉組織中CAI表現(xiàn)出上調IκBα蛋白水平以及下調磷酸化IKKα/β體現(xiàn)出對NF-κB信號通路有效的抑制。并且CAI下調血

12、清中的IL-6和TNF-α的含量，也下調肌肉中的TNF-α的水平。在體外實驗中CAI體現(xiàn)出對SIRT1酶的直接激活作用，在腓腸肌組織中CAI組小鼠的SIRT1蛋白表達量顯著上升。
　　11.CAI在體外可以劑量依賴的提升細胞內磷酸化ACC的水平。
　　12.CAI的提升磷酸化ACC水平的作用是非依賴CaMKKβ和LKB1的，同時是部分依賴于SIRT1和PKA活力的。
　　結論：
　　CAI與索拉非尼在體內與體外實