重組Kallistatin抗腫瘤血管生成活性及其分子機(jī)制研究.pdf

1、血管生成是一種重要生理活動(dòng)現(xiàn)象,包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化、增殖、遷移、血管基底膜破壞、形成新的血管和血管網(wǎng),并且與已存在的血管網(wǎng)連接。尤其在實(shí)體瘤的生長過程中,血管生成為腫瘤的生長提供必要的營養(yǎng)供給。隨著腫瘤血管生成概念的提出,以腫瘤血管生成為藥物靶點(diǎn),為抗癌藥物研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ),開發(fā)應(yīng)用高效的抑制腫瘤血管生成藥物在抗腫瘤治療中顯得尤為重要,成為當(dāng)前抗腫瘤藥物研制的重要方向之一。
　　Kallistatin(Kal)又稱組織激肽釋

2、放酶結(jié)合蛋白,具有獨(dú)特的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性,隨后發(fā)現(xiàn)其參與高血壓、炎癥、血管生成、腫瘤等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程,是一個(gè)極具臨床應(yīng)用前景的蛋白類藥物。目前對Kal抑制腫瘤新生血管生成和腫瘤生長的能力已被證實(shí),但是其確切的分子作用機(jī)制尚不清楚,本研究將通過酵母菌發(fā)酵并純化得到重組Kallistatin蛋白(rhKal),通過體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證其抗腫瘤血管生成的藥理活性,并進(jìn)一步研究其分子作用機(jī)制。
　　首先將含有pPIC9-K

3、al質(zhì)粒的GS115(His4)菌體,用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá),離心后留上清,然后經(jīng)過疏水作用(Phenylsepharose TM)、凝膠過濾層析(Sephade TMG-25)和親和層析(Heparin Sepharose)分離純化制備出rhKal蛋白純品,并進(jìn)行驗(yàn)證。其次,以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為研究對象,通過體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究,考察在血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)刺激作用下,人源重組Kallistatin對HUVEC增殖、

4、遷移、侵襲、小管生成等生物活性的影響,并初步研究了rhKal對VEGF介導(dǎo)的VEGFR-2受體活性及下游信號通路活化的影響,進(jìn)而了解rhKal抗血管生成的分子機(jī)制。再次,為了明確rhKal對腫瘤血管生成的影響,體外模擬了腫瘤環(huán)境,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察rhKal對乳腺癌MCF-7細(xì)胞株刺激的HUVEC血管生成的作用,進(jìn)一步研究了人源重組Kal抗腫瘤血管作用與NF-κB信號通路之間的關(guān)系。通過檢測了不同濃度rhKal對乳腺癌MCF-7細(xì)胞和HUV

5、EC細(xì)胞P65、I-κBα、磷酸化I-κBα、IKK蛋白及其磷酸化的影響,進(jìn)一步利用western-blotting法檢測P65、P50核轉(zhuǎn)位變化,利用報(bào)告基因技術(shù)研究對P65蛋白轉(zhuǎn)錄活化的影響;同時(shí)檢測了rhKal對NF-κB傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)的血管生成相關(guān)基表達(dá)的影響。最后,為了進(jìn)一步驗(yàn)證 rhKal抗血管生成作用和 NF-κB之間的關(guān)系,我們構(gòu)建了p65基因真核表達(dá)質(zhì)粒,分別導(dǎo)入乳腺癌MCF-7細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞,觀察外源性p65基因

6、對細(xì)胞凋亡、侵襲,以及對rhKal蛋白抑制血管生成相關(guān)基因的影響。
　　以上的研究結(jié)果表明,rhKal明顯抑制了VEGF誘導(dǎo)的血管生成,其分子機(jī)制部分可能與阻斷了 VEGFR-2信號通路相關(guān);在體外腫瘤環(huán)境中,rhKal同樣可以抑制了乳腺癌細(xì)胞對血管生成的促進(jìn)作用,其分子機(jī)制可能與rhKal阻斷了NF-κB信號通路相關(guān),從而抑制了其下游與血管生成相關(guān)靶基因的表達(dá)。綜上所述,整體結(jié)果表明rhKal具有明顯的抗腫瘤血管作用,是一個(gè)極具