小分子類肽APN抑制劑的活性評價及其抗腫瘤作用機制研究.pdf

1、腫瘤是一種嚴重威脅人類健康的疾病，其死亡率僅次于心、腦血管類疾病。而導致癌癥患者死亡的一個重要原因是腫瘤細胞的侵襲與轉移。在腫瘤的治療過程中，由于惡性腫瘤易于轉移、擴散等原因，至今尚無有效的治療方法。因此，抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移成為治療惡性腫瘤的一個重要手段。
　　 腫瘤細胞的轉移是一個非常復雜的過程，其中包括腫瘤細胞對細胞外基質的降解，血管壁的穿透以及腫瘤細胞的轉移，腫瘤組織新生血管生成等一系列過程。氨肽酶N(Aminope

2、ptidase N，APN，EC3.4.11.2)在此過程中起到了極其重要的作用。APN也被稱為CD13，是一種Ⅱ型膜結合型鋅離子依賴性金屬蛋白酶，最初是在鑒別人白血病分類的特異性標記物時提到的。該蛋白的功能較為復雜，在不同的組織行使不同的功能，但主要與其蛋白水解活性有關。APN能水解寡肽，尤其是從小肽鏈的N端降解中性氨基酸，參與生物活性肽的激活或降解、腫瘤細胞侵襲時細胞外基質的降解、抗原呈遞細胞的抗原呈遞等多種生物學過程。因為APN分

3、布廣泛，其功能在很大程度上取決于其分布，在腸內絨毛上緣，APN參與小肽的降解和氨基酸的清除；在突觸膜內，APN能使內啡肽和腦啡肽降解失活；在腎中，APN參與腎素-血管緊張素系統(tǒng)功能調節(jié)，能降解血管緊張素Ⅲ。另外，APN還參與炎癥反應，作為病毒受體介導病毒感染等。
　　 鑒于APN在腫瘤新生血管生成中的重要作用，該酶的信號轉導在血管內皮細胞中研究的較為活躍。在腫瘤微環(huán)境下，活化的內皮細胞中APN的表達主要受血管生長信號在轉錄水平上

4、的調節(jié)，APN的轉錄受到兩條Ras信號通路的調節(jié)：Ras/分裂素激活的蛋白激酶MAPK通路和3-磷脂酰肌醇激酶P13K通路。阻斷這兩條信號通路中的任意一條都不能完全抑制APN mRNA的轉錄，這兩條信號通路最終匯聚于Erk，抑制Erk才能完全抑制APN的表達。內皮細胞中，胞內信號通過磷酸化激活轉錄因子Ets-2，磷酸化的Ets-2結合APN基因的近端啟動子，啟動APN的轉錄，發(fā)揮生物學功能，調節(jié)內皮細胞的生理功能。APN蛋白的胞內部分只

5、有8～10個氨基酸殘基，因此，一般認為APN不能直接向胞內傳遞信號，但APN的底物包括IL-6、IL-8、神經肽、腦啡肽等，APN對這些底物的降解會一定程度上影響其信號轉導，至于APN是否還通過其它細胞因子影響信號轉導，目前還不清楚。
　　 原發(fā)腫瘤或繼發(fā)腫瘤生長到超過1～2 mm3時，就必須有新生血管生成提供足夠的血液供應，新生血管生成是一個非常復雜的過程，這包括受血管生長因子刺激的內皮細胞穿過基底膜侵襲、轉移、增殖等過程，并

6、最終在腫瘤組織內形成血管結構。血管生成受多種腫瘤細胞或宿主細胞分泌的細胞因子的調節(jié)，在腫瘤微環(huán)境中，內皮細胞APN mRNA和蛋白水平都有上調，用抗APN的單克隆抗體或功能性抑制劑如Bestatin，能顯著的抑制毛細管網絡的形成，這表明此金屬蛋白酶在新血管生成后期是一個重要的血管生成激活劑。細胞外基質的主要成分是多糖和纖維蛋白，因此，通過以膠原和蛋白聚糖為基本骨架的纖維網狀復合物，細胞外基質將細胞外與細胞內連成一個有機的整體，這對維持細

7、胞連接的穩(wěn)定性和細胞間的信號轉導都起到了非常重要的作用。同時這對腫瘤細胞的轉移也設置了障礙，因此基底膜的降解是腫瘤細胞轉移過程中的重要環(huán)節(jié)，APN因其蛋白水解活性在腫瘤細胞的生長、侵襲過程中起非常重要的作用。細胞外基質中Ⅳ型膠原就是APN的底物，在非小細胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌中，APN的表達可能導致患者預后較差，并且推測APN表達與腫瘤細胞的轉移擴散存在相關性。
　　 另外，APN還參與了免疫調節(jié)過程和病毒的感染。目前已知AP

8、N能通過降解抗原肽N端的數個氨基酸干擾抗原呈遞；在造血系統(tǒng)中，細胞表面的APN能調節(jié)細胞的局部微環(huán)境影響造血細胞的分化。病毒感染細胞的過程需要細胞表面受體的介導，而APN正是多種病毒的細胞表面受體，病毒與受體結合后，引發(fā)細胞的內吞作用，病毒得以進入細胞。
　　 鑒于以上原因，本研究課題致力于篩選靶向APN的抗腫瘤先導化合物。通過一系列試驗，評價了各受試化合物的抗腫瘤活性，并最終篩選得到化合物13f作為APN抑制劑類先導化合物進行

9、研究、開發(fā)。APN抑制劑的抗腫瘤機制一直不清楚，本課題還初步研究了APN抑制劑的抗腫瘤作用機制，發(fā)現(xiàn)Fascin蛋白在APN抑制劑的抑制細胞遷移過程中發(fā)揮重要作用。另外，我們還發(fā)現(xiàn)不同物種來源的氨肽酶N空間結構對APN抑制劑的活性評價存在影響。因此，對化合物進行活性評價時，應以人源氨肽酶N進行最終的評價?，F(xiàn)將各部分的主要內容介紹如下：
　　 第一部分 APN抑制劑的活性評價本部分內容，主要從分子和細胞水平上研究本實驗室首次設計合

10、成的環(huán)酰亞氨類APN抑制劑的生物活性。小分子環(huán)酰亞胺類肽是基于APN為作用靶點而設計合成的一系列APN抑制劑類抗癌先導化合物，其設計思想結合了肽類似物和構象限制原則，并且此類化合物的藥效團結構與Bestatin較為相似。另外，APN的功能與血管生成和腫瘤細胞的侵襲密切相關，而受試化合物也確實能抑制內皮細胞血管生成及腫瘤細胞的侵襲。
　　 首先，我們用流式細胞術檢測了不同腫瘤細胞APN的表達情況，結果表明：人髓性白血病細胞HL-6

11、0、人卵巢透明細胞癌ES-2、人肺泡上皮細胞癌A549、人肝癌細胞PLC/PRF/5 APN表達量相對較高，人肝癌細胞HepG2、H7402、人膠質瘤細胞A172、U87 APN表達量相對較低，而人髓性白血病細胞K562不表達APN或表達量非常低。根據試驗數據及文獻報道，我們選用HL-60、ES-2細胞檢測APN抑制劑的活性。
　　 根據本課題組李乾斌博士測定的酶活性數據，我們選出一系列化合物，用細胞模型評價了其抗腫瘤活性。MT

12、T試驗結果表明，所有化合物均能夠在一定程度上抑制HL-60細胞的活力，結合抑酶活性數據及細胞活力抑制數據，我們篩選出三個化合物：13d、13f、22f，做進一步的活性評價，檢測了抑制劑對HL-60細胞表面APN的抑酶活性；受試化合物對卵巢癌ES-2、肺癌A549細胞活力的影響，結果表明受試化合物均能明顯的抑制APN的活性及腫瘤細胞的活力。另外，根據氨肽酶N的生物學功能，我們還檢測了這三個化合物對細胞周期、血管生成及腫瘤細胞侵襲的影響。受

13、試化合物均能明顯的影響HL-60細胞有絲分裂；抑制人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)血管生成及卵巢癌ES-2細胞侵襲。但對低表達APN的K562細胞的活力影響不大，這表明受試化合物對APN具有一定的選擇性。另外，我們還測定了受試化合物對APN的抑制常數；應用計算機SYBYL軟件做了分子動力學模擬，構建了3D-QSAR模型，用于分析抑制劑的構效關系并指導新的APN抑制劑的合成。
　　 綜合所有活性試驗數據，我們選定化合物13f開發(fā)潛力

14、最大，可能成為新的APN抑制劑類抗腫瘤藥物。該研究結果發(fā)表在Fundam Clin Pharmacol.2010 Jul15上。
　　 第二部分 APN抑制劑抗腫瘤細胞遷移機制的研究Fascin也被稱為Fascin1，是一種能與肌動蛋白結合的球狀蛋白，該蛋白主要把肌動蛋白絲組織成嚴密的束構成層狀粘足和絲狀偽足，而這兩種結構是細胞突觸的主要成分，細胞突觸在細胞感應外部環(huán)境、細胞遷移時起非常重要的作用，因此，在細胞遷移過程中，F(xiàn)as

15、cin是一個非常重要的蛋白。在許多癌癥中Fascin表達都上調，例如：胃癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌。因此，F(xiàn)ascin已成為一個新型的候選腫瘤標志物和治療靶點。
　　 本部分內容主要研究陽性對照藥(Bestatin)和我們首次合成的(13f)APN抑制劑的抗腫瘤細胞遷移機制，本研究首次發(fā)現(xiàn)Fascin表達下降與APN抑制劑的抑制遷移活性有關。MAPK信號通路中Erk1/2的磷酸化也受APN抑制劑的時間、濃度依賴性影響。然而，MAP

16、K信號通路阻斷劑PD98059并不能抑制Fascin的表達。另外，我們還發(fā)現(xiàn)APN抑制劑通過P13K/Akt信號通路調節(jié)MMP-2的表達。
　　 在試驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)APN抑制劑對高表達APN的卵巢癌ES-2細胞的形態(tài)有影響，加藥處理后細胞變的細長，類似于成纖維細胞，而對于低表達APN的肝癌HepG2細胞，影響不大。細胞形態(tài)與細胞骨架密切相關，因此我們推測，細胞遷移速率也會隨細胞骨架而受到影響。劃痕試驗結果表明Bestatin

17、和13f均能明顯的抑制ES-2細胞的遷移，Bestatin較13f活性高。隨后，我們用Western blot試驗檢測了細胞骨架相關蛋白Fascin的表達情況。結果表明，APN抑制劑抑制卵巢癌ES-2細胞遷移的同時，F(xiàn)ascin的表達也受到了影響，為了確認Fascin是否在APN抑制劑抑制細胞遷移過程中起重要作用，我們構建了pcDNA3.1-Fascin質粒，與轉染pcDNA3.1空質粒的對照組相比，過表達Fascin確實能影響APN抑

18、制劑的抑制細胞遷移作用。因此，綜合相關數據，我們得出結論：APN抑制劑是通過抑制Fascin蛋白的表達抑制卵巢癌ES-2細胞的遷移。
　　 大鼠乳腺上皮細胞Con8中，TGF-α能通過MEK-MAPK依賴性的通路抑制地塞米松對Fascin的下調作用，因此我們猜測APN抑制劑是否也通過MAPK信號通路下調Fascin。然而，Western blot結果表明盡管APN抑制劑能以時間、濃度依賴性的方式抑制Erk1/2的磷酸化，但MEK

19、抑制劑PD98059并不能抑制卵巢癌ES-2細胞Fascin的表達。因此，卵巢癌ES-2細胞中，F(xiàn)ascin的表達不受MAPK信號通路的調節(jié)。另外，我們發(fā)現(xiàn)APN抑制劑能上調基質金屬蛋白酶MMP-2 mRNA、蛋白的水平，并且APN抑制劑也能上調Akt磷酸化，同時P13K激酶特異性抑制劑LY294002不僅能阻斷P13K依賴的Akt磷酸化，還能濃度依賴性的抑制MMP-2的表達，所有這些數據都表明APN抑制劑可以通過P13K/Akt信號通

20、路上調MMP-2的表達。該研究結果已投稿。
　　 第三部分不同物種來源的氨肽酶N空間結構對APN抑制劑活性評價的影響本課題組合成的新型APN抑制劑161可以明顯的抑制豬氨肽酶N的活性，且抑制常數也與陽性藥Bestatin相當。然而，我們用人腫瘤細胞檢測其活性時，161并不能有效的抑制氨肽酶N的活性及細胞活力、細胞遷移和侵襲。兩個化合物抑制小鼠APN活性時，抑制率也相差較大。另外，我們用HPLC檢測，161并沒有被細胞降解。因此，

21、我們推測可能是由于不同物種來源的APN三維空間結構的差異導致兩個化合物的抑酶活性相差較大。借助計算機輔助分子模擬分析表明，由于空間結構上的不同，化合物161在人和豬APN結合位點的結合方式存在較大差別。因此，用豬氨肽酶N進行APN抑制劑的活性篩選只能作為初篩手段，而真正的活性評價應以人氨肽酶N作為酶源。該研究結果發(fā)表在Biol.Pharm.Bull.2010 Oct；33(10)上。
　　 結論
　　 本研究首先評價了一

22、系列APN抑制劑的活性，并從中選出三個較有潛力的化合物進行后續(xù)的研究，通過多種活性評價試驗，最終選定化合物13f活性較好，有望作為APN抑制劑類抗腫瘤先導物進行開發(fā)。我們還對APN抑制劑的抗腫瘤細胞遷移機制，進行了初步的探討。研究發(fā)現(xiàn)Fascin在腫瘤細胞遷移過程中起到了非常重要的作用，APN抑制劑也正是通過抑制Fascin的表達，抑制腫瘤細胞遷移。對信號通路的研究表明，APN抑制劑對MAPK、P13K/Akt信號通路均有影響，通過P1

23、3K/Akt通路，APN抑制劑能上調基質金屬蛋白酶MMP-2的表達。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，由于空間結構上的不同，APN抑制劑與人和豬氨肽酶N的結合方式存在較大差別。因此，用豬氨肽酶N進行APN抑制劑的活性篩選只能作為初篩手段，而真正的活性評價應以人氨肽酶N作為酶源。上述研究篩選到一個活性較高、新合成的APN抑制劑，并對APN抑制劑的抗腫瘤細胞遷移機制進行了初步探討，這對合成新型的APN抑制劑，以及腫瘤治療，提供了一定的理論和實驗基礎。