酪氨酸激酶小分子抑制劑的設計、合成及抗腫瘤活性研究.pdf

1、癌癥（惡性腫瘤）是當今世界嚴重危害人類健康和生命的疾病之一，傳統(tǒng)的腫瘤治療方法主要有外科治療、內科治療和放射治療，其他方法還包括免疫治療、介入治療、熱療等。臨床上常用的抗腫瘤藥物大都屬細胞毒藥物，這些抗腫瘤藥物具有難以避免的選擇性差、毒副作用強、易產生耐藥性等缺點。隨著分子生物學、腫瘤基因學等研究的不斷深入，惡性腫瘤細胞內的信號傳導、細胞周期的調控、細胞凋亡的誘導、血管生成以及細胞與細胞外基質的相互作用等各種基本過程正在被逐步闡明。研究

2、發(fā)現(xiàn)某些與腫瘤細胞分化增殖相關的細胞信號轉導通路的關鍵酶可作為藥物篩選靶點，基于這些靶點的藥物具有高效、低毒、特異性強等特點。蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinases，PTK)是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質，它們在細胞內的信號轉導通路中占據了十分重要的地位，調節(jié)著細胞體內生長、分化、凋亡等一系列的生理生化過程。蛋白酪氨酸激酶功能的失調會引發(fā)生物體內的一系列疾病，已有的資料表明，超過50％的原癌基因和癌基因產物都

3、具有蛋白酪氨酸激酶活性，它們的異常表達將導致細胞增殖調節(jié)發(fā)生紊亂，進而導致腫瘤發(fā)生。此外，酪氨酸激酶的異常表達還與腫瘤的侵襲和轉移，腫瘤的血管生成，腫瘤的化療抗藥性密切相關。因此，以酪氨酸激酶為靶點進行藥物研究成為國際上抗腫瘤藥物研究的熱點。目前已有8種小分子酪氨酸激酶抑制劑上市，進一步證實了此類靶點的有效性。
　　 本論文綜述了酪氨酸激酶及其小分子抑制劑的研究進展，并對最新報道的幾類酪氨酸激酶抑制劑進行定量構效關系(QSAR)

4、研究，闡明了抑制劑產生激酶抑制活性所必需的結構特征。分別以上市的酪氨酸激酶抑制劑Sorafenib和Dasatinib作為先導物，設計合成了兩大類5個系列目標化合物，并測試了這些化合物在體外的抗腫瘤增殖活性，基于活性測試的結果進行了構效關系分析和分子對接研究。具體研究內容如下：
　　 1.酪氨酸激酶可分為受體型酪氨酸激酶(RTKs)和非受體型酪氨酸激酶(NRTKs)兩種。RTKs可活化多個最重要的下游信號級聯(lián)，其中包括ERK/M

5、APK信號通路，PI-3激酶/AKT信號通路以及磷脂酶γ/PKC信號通路。PTKs維持所有這些不同轉導途徑中相互問的信號通訊，并最終調控基因的轉錄。NRTKs的調節(jié)機制差異較大，它們與跨膜受體（例如激素、細胞因子和生長因子受體）結合后可使其發(fā)生二聚化，進而激活JAK/STAT信號通路。在JAK催化下，STAT二聚體轉移入細胞核內并與DNA啟動子的活化序列結合，誘導靶基因的表達，促進多種蛋白質的合成，進而增強細胞抵御病毒感染的能力。研究發(fā)

6、現(xiàn)PTKs與腫瘤的產生和發(fā)展有著直接或間接的聯(lián)系，因而酪氨酸激酶抑制劑應用于腫瘤治療尤為合適，其有效性已逐漸在酶、細胞及動物水平上得到驗證。本論文對近來研究較多的酪氨酸激酶靶點及其小分子抑制劑進行了綜述，包括VEGFR激酶、Src家族激酶和BCR-ABL激酶。
　　 2.為了明確小分子酪氨酸激酶抑制劑產生激酶抑制活性所必需的結構特征，本論文分別對新型Src激酶抑制劑3－氰基喹啉類化合物及VEGFR激酶抑制劑二芳基脲類化合物進行了

7、二維定量構效關系(2D-QSAR)研究。首先，我們采用了非監(jiān)督的模式識別方法如層級聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)和穩(wěn)健主成分分析(ROBPCA)法考察了所有樣本在二維或多維空間的分布，并根據均勻分布原則將樣本合理地分為訓練集和測試集，以用于模型的建立及驗證；隨后，本研究建立并比較了多種變量選擇算法：包括前向選擇算法(Forward selectioN,FS)，遺傳算法(Genetic algorithm，GA)，模擬退火算法(

8、Simulated annealing，SA)，改良的替代算法(Enhanced replacement method，ERM))結合線性回歸模型(Multiple linear regressioN,MLR)及非線性支持向量回歸模型(Support vector regressioN,SVR)在挖掘化合物結構特征與其激酶抑制活性關系的能力。研究發(fā)現(xiàn)雖然非線性的SVR算法遠遠復雜于ERM算法，但在本研究中基于ERM的回歸模型具有最佳的擬

9、合及預測能力。本研究還引入了Y－隨機化分析及預測力驗證兩項指標，從而進一步保證了模型的穩(wěn)健性及可靠性。此外，為了深入探討影響化合物活性高低的結構特性，本研究還采用了線性判別分析(LDA)和支持向量機(SVM)對這兩類化合物進行了分類研究，建立了具有較高分類準確度的判別模型，并初步明確了決定化合物活性高低的結構特征?？傮w而言，該部分研究不僅建立了具有較強預測能力的回歸/分類模型，更重要的是從分子結構特征方面很好地把握了3－氰基喹啉類和二芳

10、基脲類化合物產生激酶抑制活性的結構特征，尤其是決定化合物活性高低的結構特征，為隨后的化合物設計/優(yōu)化提供了初步的理論指導。
　　 3.我們以Sorafenib作為先導化合物，首先利用計算機輔助藥物設計對二芳基脲類化合物進行定量構效關系(QSAR)研究，確定該類化合物產生激酶抑制活性的結構特征，再基于對Sorafenib的構效關系(SAR)分析，運用環(huán)合原理和生物電子等排原理等藥物設計的基本方法，將末端甲酰胺基團通過環(huán)合，得到五元

11、雜環(huán)噻唑環(huán)和咪唑環(huán)，并用不同取代的苯胺替換三氟甲基苯胺，設計了Ⅰ類目標化合物22個。其中，五元雜環(huán)起到“擬酰胺”的構象限制的作用。此外，采用SYBYL軟件將目標分子與B-Raf蛋白進行對接，產生了抑制劑與靶酶的復合物模型，證實了目標分子設計上的合理性。合成的22個目標化合物均未見文獻報道，結構經1H-NMR、13C－NMR、MS、IR及EA確證。
　　 4.以Dasatinib作為先導化合物，首先利用計算機輔助藥物設計對2－氨基

12、苯并[d]噻唑類化合物進行定量構效關系(QSAR)研究，確定該類化合物產生激酶抑制活性的結構特征；再基于Dasatinib的構效關系分析，運用增環(huán)原理和拼合原理等藥物設計的基本方法，用喹唑啉環(huán)替代Dasatinib結構中的嘧啶環(huán)，以苯并噻唑環(huán)替換噻唑環(huán)，以其它極性取代基替換4－羥乙基哌嗪部分，并用其他2，6位連有小取代基的苯胺代替2－氯-6-甲基苯胺環(huán)，成功設計出具有4－氨基喹唑啉基苯并[d]噻唑類母核的Ⅱ類目標化合物19個。此外，采用

13、SYBYL軟件將目標分子與Lyn蛋白進行對接，產生了抑制劑與靶酶的復合物模型，證實了目標分子的設計合理性。合成的19個目標化合物均未見文獻報道，結構經1H-NMR、13C－NMR、MS、IR及EA確證。
　　 5.對41個目標化合物進行了體外抗腫瘤活性測試，Ⅰ系列22個目標化合物中有8個化合物能夠顯著抑制人非小細胞肺癌細胞株(A549)和人乳腺癌細胞株(MDA-MB-231)，與陽性對照藥Sorafenib活性相當。其中化合物I

14、a-2、Ia-4、Ia-6、Ia-9對A549細胞的抑制活性，以及Ia-2、Ia-4、Ia-9對MDA-MB-231細胞的抑制活性均超過了陽性對照藥Sorafenib，可作進一步酶活性以及體內活性篩選研究。Ⅱ系列19個目標化合物中有11個化合物能夠顯著抑制人結腸癌細胞株(HCT-116)和(DLD1)，其中Ⅱa-1、Ⅱa-3、Ⅱa-6、Ⅱb-7、Ⅱe-1、Ⅱc-3、Ⅱc-4、Ⅱc-5、Ⅱc-6對HCT-116和DLD1的抑制活性與陽性對

15、照藥Dasatinib活性相當。
　　 6.根據生物活性測試結果，對化合物構效關系進行了總結，Ⅰ類二芳基脲系列化合物，8個活性較好的化合物中，有6個是噻唑類Ⅰa系列化合物，2個是咪唑類Ⅰb系列化合物，Ⅰa系列的活性明顯好于Ⅰb系列。當與脲基團相連苯環(huán)的間位都具有強吸電子取代基(如CF3,NO2)時化合物的活性較好，尤其以CF3取代活性更好。Ⅱ類2－氨基苯并[d]噻唑系列化合物，酰胺部分為2－氯-6-甲基苯胺Ⅱa系列和2，4，6-