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文檔簡(jiǎn)介
1、第一部分:研究背景:
端粒酶是一種專(zhuān)一依賴(lài)RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶,與細(xì)胞調(diào)控及惡性腫瘤形成密切相關(guān),其活性升高是細(xì)胞永生化和惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中最重要的特征之一。人端粒酶包括3種組分:端粒酶RNA(human telomersase RNA,hTR)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)及連結(jié)二者的端粒酶連結(jié)蛋白(Telomerase associated prot
2、ein1,TP1)。其中hTERT與端粒酶活性密切相關(guān),被認(rèn)為是大多數(shù)細(xì)胞端粒酶激活的限速酶[1]。組蛋白去乙?;敢种苿?histone deacetylases inhibitors,HDACi)曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)通過(guò)抑制組蛋白去乙?;甘辜?xì)胞乙酰化蛋白增加,選擇性抑制和激活細(xì)胞大量基因轉(zhuǎn)錄,具有特異的腫瘤殺傷效應(yīng)[2,3]。因此,本項(xiàng)目從建立Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡模型入
3、手,觀察Trichostatin A誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的時(shí)間和量效關(guān)系。同時(shí)檢測(cè)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在Trichostatin A誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的表達(dá)變化,以此為基礎(chǔ),探討Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)方法:
Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡模型的建立:(1)倒置相差顯微鏡下觀察Trichostatin A作用宮頸癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。(2)磺酰羅丹明
4、B(RSB)法檢測(cè)Trichostatin A作用宮頸癌細(xì)胞凋亡的時(shí)間和量效關(guān)系;(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期改變和凋亡情況。
Trichostatin A誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中hTERT表達(dá)的變化:(1)RT-PCR檢測(cè)hTERT和p21Waf1基因在Trichostatin A誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的變化;(2)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)hTERT的細(xì)胞定位和表達(dá)變化;(3)免疫熒光結(jié)合流式檢測(cè)Trichostatin
5、 A作用前后hTERT蛋白表達(dá)變化。(4)PCR-TRAP-ELISA法檢測(cè)hTERT表達(dá)變化后端粒酶活性的改變。(5)熒光原位雜交法檢測(cè)hTERT表達(dá)變化后端粒長(zhǎng)度的改變。
hTERT顯性負(fù)突變體在Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用:
(1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染顯性負(fù)突變(dominant negative,DN)hTERT、野生型(wild type,WT)hTERT,觀察hTERT在T
6、richostatin A誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡中的作用。(2)PCR-TRAP-ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同hTERT質(zhì)粒后端粒酶活性的變化(3)磺酰羅丹明B(RSB)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同hTERT質(zhì)粒的穩(wěn)定細(xì)胞系在Trichostatin A作用下增殖差異;(4)Annexin V/ PI流式檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞系在Trichostatin A作用下的早期凋亡情況。(5)western blot檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞系在Trichostatin A作用下
7、p21waf1和p53的表達(dá)變化。
結(jié)果:
通過(guò)Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡模型的建立,觀察到宮頸癌細(xì)胞在Trichostatin A作用下細(xì)胞發(fā)生明顯變化,細(xì)胞折光性降低;48h后細(xì)胞變圓飄浮,胞膜皺縮,可見(jiàn)凋亡小體和核碎裂;RSB法證實(shí)Trichostatin A對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制隨藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯,具有顯著的時(shí)效和量效相關(guān)性。流式細(xì)胞檢測(cè)證明Trichos
8、tatin A作用宮頸癌細(xì)胞后細(xì)胞周期阻滯,隨后細(xì)胞發(fā)生凋亡。
Trichostatin A作用細(xì)胞后,hTERT mRNA隨誘導(dǎo)時(shí)間的變化具有一定的動(dòng)態(tài)規(guī)律,而p21waf1的表達(dá)則升高。激光共聚焦顯微鏡和免疫熒光結(jié)合流式細(xì)胞儀分析從蛋白水平驗(yàn)證了mRNA水平的動(dòng)態(tài)變化。而進(jìn)一步的端粒酶活性檢測(cè)和端粒長(zhǎng)度的測(cè)定也證實(shí)了端粒酶活性和端粒長(zhǎng)度隨hTERT的表達(dá)變化發(fā)生相應(yīng)的改變。以上結(jié)果提示hTERT有可能成為T(mén)richos
9、tatin A的作用靶點(diǎn)。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染顯性負(fù)突變(dominant negative,DN)hTERT、野生型(wild type,WT)hTERT后,轉(zhuǎn)染DN-hTERT的細(xì)胞端粒酶的活性明顯下降,而轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-hTERT的細(xì)胞端粒酶活性則升高。端粒酶活性在不同的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的差異進(jìn)一步表現(xiàn)在細(xì)胞增殖和對(duì)Trichostatin A誘導(dǎo)凋亡的耐受方面:轉(zhuǎn)染DN-hTERT的細(xì)胞增殖速度減慢,對(duì)Trichostatin A誘
10、導(dǎo)的凋亡敏感,而轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-hTERT的細(xì)胞則相反。Western blot檢測(cè)這種凋亡上的差異有可能是由于不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞系p21waf1表達(dá)的差異引起,這種差異不依賴(lài)于p53的表達(dá)變化。
結(jié)論:
1 Trichostatin A可以選擇性誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。
2 hTERT在Trichostatin A誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中表達(dá)發(fā)生一定的變化。
3 hTERT作為T(mén)richosta
11、tin A的作用靶點(diǎn),外源性干預(yù)其表達(dá)可以改變腫瘤細(xì)胞對(duì)Trichostatin A的敏感性,這種敏感性的改變通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21waf1實(shí)現(xiàn)。
第二部分:研究背景:
組蛋白去乙?;敢种苿┦且活?lèi)新型的非細(xì)胞毒類(lèi)抗癌化療藥物,在I、II期臨床試驗(yàn)中取得了令人振奮的結(jié)果,顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。作為一種新的腫瘤治療概念,HDAC抑制劑與傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類(lèi)化療藥物不同,其具有在腫瘤與宿主正常細(xì)胞間選擇性殺滅腫
12、瘤細(xì)胞的特性,說(shuō)明其核心作用靶點(diǎn)具有明顯的腫瘤特異性。然而,國(guó)內(nèi)外對(duì)HDAC抑制劑的廣譜抗腫瘤的作用靶點(diǎn)的認(rèn)識(shí)仍然不夠明確。雖然有報(bào)道顯示一些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白可能作為其靶點(diǎn),但類(lèi)似的研究仍然是零散、相對(duì)不完善的,因此,我們?cè)诘谝徊糠盅芯康幕A(chǔ)上,采用一種全新的,基于功能效應(yīng)為基礎(chǔ)的篩選手段:SMART(Suppression of Mortality by Antisense Rescue Techique)技術(shù)克隆HDAC抑制劑的作用
13、靶點(diǎn),試圖以一種新的角度來(lái)闡明HDAC抑制劑特異性抗腫瘤的作用機(jī)理,發(fā)現(xiàn)其新的作用靶點(diǎn),發(fā)展腫瘤細(xì)胞凋亡的新的調(diào)控機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)方法:
Trichostatin A誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡反義cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和凋亡效應(yīng)基因的篩選及鑒定:實(shí)驗(yàn)路線及流程見(jiàn)下表:
結(jié)果:
經(jīng)MTT,流式細(xì)胞儀證實(shí)250nmol/L Trichostatin A能誘導(dǎo)MCF-7和HeLa細(xì)胞凋亡,提
14、取處于凋亡不同時(shí)期的MCF-7細(xì)胞mRNA,提取mRNA后建立的反義cDNA文庫(kù)片段插入率大于90[%],平均長(zhǎng)度約為1.5kb,庫(kù)容約為2×105;將此文庫(kù)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,經(jīng)過(guò)篩選得到陽(yáng)性克隆后,Hirt DNA提取轉(zhuǎn)化,經(jīng)酶切測(cè)序獲得76個(gè)EST片度。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析,選定Liv-1、Smad4和Ubiquitin B進(jìn)行了詳細(xì)的機(jī)制研究。
結(jié)論:
1.成功建立了HDAC 抑制劑Tricho
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