HDAC抑制劑抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：研究背景：
　　 端粒酶是一種專(zhuān)一依賴(lài)RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶，與細(xì)胞調(diào)控及惡性腫瘤形成密切相關(guān)，其活性升高是細(xì)胞永生化和惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中最重要的特征之一。人端粒酶包括3種組分：端粒酶RNA(human telomersase RNA,hTR)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)及連結(jié)二者的端粒酶連結(jié)蛋白(Telomerase associated prot

2、ein1，TP1)。其中hTERT與端粒酶活性密切相關(guān)，被認(rèn)為是大多數(shù)細(xì)胞端粒酶激活的限速酶[1]。組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylases inhibitors，HDACi)曲古抑菌素A(Trichostatin A，TSA)通過(guò)抑制組蛋白去乙?；甘辜?xì)胞乙酰化蛋白增加，選擇性抑制和激活細(xì)胞大量基因轉(zhuǎn)錄，具有特異的腫瘤殺傷效應(yīng)[2，3]。因此，本項(xiàng)目從建立Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡模型入

3、手，觀察Trichostatin A誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的時(shí)間和量效關(guān)系。同時(shí)檢測(cè)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在Trichostatin A誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的表達(dá)變化，以此為基礎(chǔ)，探討Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡模型的建立：(1)倒置相差顯微鏡下觀察Trichostatin A作用宮頸癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。(2)磺酰羅丹明

4、B(RSB)法檢測(cè)Trichostatin A作用宮頸癌細(xì)胞凋亡的時(shí)間和量效關(guān)系；(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期改變和凋亡情況。
　　 Trichostatin A誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中hTERT表達(dá)的變化：(1)RT-PCR檢測(cè)hTERT和p21Waf1基因在Trichostatin A誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的變化；(2)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)hTERT的細(xì)胞定位和表達(dá)變化；(3)免疫熒光結(jié)合流式檢測(cè)Trichostatin

5、 A作用前后hTERT蛋白表達(dá)變化。(4)PCR-TRAP-ELISA法檢測(cè)hTERT表達(dá)變化后端粒酶活性的改變。(5)熒光原位雜交法檢測(cè)hTERT表達(dá)變化后端粒長(zhǎng)度的改變。
　　 hTERT顯性負(fù)突變體在Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用：
　　 (1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染顯性負(fù)突變(dominant negative，DN)hTERT、野生型(wild type，WT)hTERT，觀察hTERT在T

6、richostatin A誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡中的作用。(2)PCR-TRAP-ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同hTERT質(zhì)粒后端粒酶活性的變化(3)磺酰羅丹明B(RSB)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同hTERT質(zhì)粒的穩(wěn)定細(xì)胞系在Trichostatin A作用下增殖差異；(4)Annexin V/ PI流式檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞系在Trichostatin A作用下的早期凋亡情況。(5)western blot檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞系在Trichostatin A作用下

7、p21waf1和p53的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 通過(guò)Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡模型的建立，觀察到宮頸癌細(xì)胞在Trichostatin A作用下細(xì)胞發(fā)生明顯變化，細(xì)胞折光性降低；48h后細(xì)胞變圓飄浮，胞膜皺縮，可見(jiàn)凋亡小體和核碎裂；RSB法證實(shí)Trichostatin A對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制隨藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯，具有顯著的時(shí)效和量效相關(guān)性。流式細(xì)胞檢測(cè)證明Trichos

8、tatin A作用宮頸癌細(xì)胞后細(xì)胞周期阻滯，隨后細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 Trichostatin A作用細(xì)胞后，hTERT mRNA隨誘導(dǎo)時(shí)間的變化具有一定的動(dòng)態(tài)規(guī)律，而p21waf1的表達(dá)則升高。激光共聚焦顯微鏡和免疫熒光結(jié)合流式細(xì)胞儀分析從蛋白水平驗(yàn)證了mRNA水平的動(dòng)態(tài)變化。而進(jìn)一步的端粒酶活性檢測(cè)和端粒長(zhǎng)度的測(cè)定也證實(shí)了端粒酶活性和端粒長(zhǎng)度隨hTERT的表達(dá)變化發(fā)生相應(yīng)的改變。以上結(jié)果提示hTERT有可能成為T(mén)richos

9、tatin A的作用靶點(diǎn)。
　　 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染顯性負(fù)突變(dominant negative，DN)hTERT、野生型(wild type，WT)hTERT后，轉(zhuǎn)染DN-hTERT的細(xì)胞端粒酶的活性明顯下降，而轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-hTERT的細(xì)胞端粒酶活性則升高。端粒酶活性在不同的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的差異進(jìn)一步表現(xiàn)在細(xì)胞增殖和對(duì)Trichostatin A誘導(dǎo)凋亡的耐受方面：轉(zhuǎn)染DN-hTERT的細(xì)胞增殖速度減慢，對(duì)Trichostatin A誘

10、導(dǎo)的凋亡敏感，而轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-hTERT的細(xì)胞則相反。Western blot檢測(cè)這種凋亡上的差異有可能是由于不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞系p21waf1表達(dá)的差異引起，這種差異不依賴(lài)于p53的表達(dá)變化。
　　 結(jié)論：
　　 1 Trichostatin A可以選擇性誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。
　　 2 hTERT在Trichostatin A誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中表達(dá)發(fā)生一定的變化。
　　 3 hTERT作為T(mén)richosta

11、tin A的作用靶點(diǎn)，外源性干預(yù)其表達(dá)可以改變腫瘤細(xì)胞對(duì)Trichostatin A的敏感性，這種敏感性的改變通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21waf1實(shí)現(xiàn)。
　　 第二部分：研究背景：
　　 組蛋白去乙?；敢种苿┦且活?lèi)新型的非細(xì)胞毒類(lèi)抗癌化療藥物，在I、II期臨床試驗(yàn)中取得了令人振奮的結(jié)果，顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。作為一種新的腫瘤治療概念，HDAC抑制劑與傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類(lèi)化療藥物不同，其具有在腫瘤與宿主正常細(xì)胞間選擇性殺滅腫

12、瘤細(xì)胞的特性，說(shuō)明其核心作用靶點(diǎn)具有明顯的腫瘤特異性。然而，國(guó)內(nèi)外對(duì)HDAC抑制劑的廣譜抗腫瘤的作用靶點(diǎn)的認(rèn)識(shí)仍然不夠明確。雖然有報(bào)道顯示一些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白可能作為其靶點(diǎn)，但類(lèi)似的研究仍然是零散、相對(duì)不完善的，因此，我們?cè)诘谝徊糠盅芯康幕A(chǔ)上，采用一種全新的，基于功能效應(yīng)為基礎(chǔ)的篩選手段：SMART(Suppression of Mortality by Antisense Rescue Techique)技術(shù)克隆HDAC抑制劑的作用

13、靶點(diǎn)，試圖以一種新的角度來(lái)闡明HDAC抑制劑特異性抗腫瘤的作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)其新的作用靶點(diǎn)，發(fā)展腫瘤細(xì)胞凋亡的新的調(diào)控機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 Trichostatin A誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡反義cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和凋亡效應(yīng)基因的篩選及鑒定：實(shí)驗(yàn)路線及流程見(jiàn)下表：
　　 結(jié)果：
　　 經(jīng)MTT，流式細(xì)胞儀證實(shí)250nmol/L Trichostatin A能誘導(dǎo)MCF-7和HeLa細(xì)胞凋亡，提

14、取處于凋亡不同時(shí)期的MCF-7細(xì)胞mRNA，提取mRNA后建立的反義cDNA文庫(kù)片段插入率大于90[％]，平均長(zhǎng)度約為1.5kb，庫(kù)容約為2×105；將此文庫(kù)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選得到陽(yáng)性克隆后，Hirt DNA提取轉(zhuǎn)化，經(jīng)酶切測(cè)序獲得76個(gè)EST片度。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，選定Liv-1、Smad4和Ubiquitin B進(jìn)行了詳細(xì)的機(jī)制研究。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建立了HDAC 抑制劑Tricho