HDAC抑制劑抗腫瘤效應(yīng)靶基因的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：SMART技術(shù)篩選HDAC抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡靶基因的研究
　　 目的:
　　 通過建立一種全新的、基于基因功能的篩選手段——SMART（Suppression of Mortality by Antisense Rescue Technique）技術(shù)，尋找抵抗HDAC抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的效應(yīng)基因并初步探討其作用機制。
　　 方法:
　　 250 nmol

2、/L TSA誘導(dǎo)乳腺癌細胞MCF-7凋亡，并收集處于凋亡不同時段的細胞提取mRNA，構(gòu)建反義cDNA文庫。文庫DNA隨機轉(zhuǎn)入HeLa細胞中，篩選出陽性轉(zhuǎn)染細胞克隆，存活克隆經(jīng)擴增后提取Hirt DNA，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌并測序。經(jīng)生物信息學分析后選擇感興趣的基因進行功能驗證，并進一步探討其作用機制。
　　 結(jié)果:
　　 成功構(gòu)建反義cDNA文庫，片段插入率大于90%，平均長度約為1.5kb，庫容約為2×105；運用NCBI

3、blast比對獲得76個EST片段；再次重復(fù)篩選驗證，選定LIV-1基因進行進一步研究。實驗顯示，HDAC抑制劑可以選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞中LIV-1基因的表達，平板克隆形成實驗、MTT實驗和FACS檢測凋亡實驗顯示下調(diào)LIV-1表達可以抵抗HDAC抑制劑誘導(dǎo)的細胞凋亡，這一效應(yīng)可能與封閉LIV-1后腫瘤細胞內(nèi)鋅離子穩(wěn)態(tài)被破壞有關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 SMART技術(shù)作為一種基于基因功能的篩選手段，可以高通量、特異性的獲得在

4、HDAC抑制劑誘發(fā)細胞凋亡過程中的效應(yīng)基因；基因LIV-1可能是HDAC抑制劑抗腫瘤效應(yīng)的靶基因，下調(diào)LIV-1表達可抵抗HDAC抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，這一效應(yīng)可能與封閉LIV-1后腫瘤細胞內(nèi)鋅離子穩(wěn)態(tài)被破壞有關(guān)。
　　 第二部分：粘附分子CD146在HDAC抑制劑抗腫瘤效應(yīng)中的保護作用及機制研究
　　 背景和目:的研究表明，在HDAC抑制劑的作用下，細胞中占總數(shù)17%的基因轉(zhuǎn)錄水平會發(fā)生變化。如此廣泛的作用靶點使得H

5、DAC抑制劑在啟動某些治療性反應(yīng)的同時也啟動了某些意想不到的保護性程序，后者嚴重影響到HDAC抑制劑的最佳臨床療效。目前臨床上由于HDAC抑制劑單藥用藥治療效能較低，僅被作為輔助用藥，與一些傳統(tǒng)的一線化療藥聯(lián)用，達到增強療效的目的。因此，揭示其低效能背后暗藏的分子機制對推動該類治療性藥物的臨床應(yīng)用具有重要意義。
　　 方法和結(jié)果:
　　 通過cDNA芯片分析，我們發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑作用后細胞內(nèi)大量粘附分子表達上調(diào)，其中以

6、粘附分子CD146的上調(diào)最為顯著。以CD146為代表，通過Realtime PCR、Western blot和免疫組化等方法證實了，在HDAC抑制劑的作用下，多種腫瘤細胞系、原代腫瘤細胞和動物體內(nèi)CD146被明顯上調(diào)。將CD146的單克隆抗體與HDAC抑制劑聯(lián)用顯著增強了HDAC抑制劑的促進凋亡和抑制血管生成的作用，從而抑制腫瘤惡性生長與轉(zhuǎn)移。其作用機制可能與下調(diào)PI3K/AKT/mTOR通路的活性有關(guān)。
　　 結(jié)論: