新型微管蛋白抑制劑的研發(fā)和抗腫瘤機制研究.pdf

1、研究背景與目的:微管是構(gòu)成細胞骨架的主要成分，存在于所有的真核細胞中，與其他蛋白共同組裝成紡錘體、中心粒、鞭毛、神經(jīng)管等多種結(jié)構(gòu)。正常條件下，微管的聚合和解聚保持著動態(tài)平衡，因此細胞分裂高度可控，進展有序。這種不穩(wěn)定的動力學(xué)特性使得微管在維持細胞形態(tài)、細胞遷移、細胞有絲分裂、胞內(nèi)物質(zhì)的輸送及信號傳導(dǎo)等細胞關(guān)鍵生物學(xué)過程中具有重要調(diào)節(jié)功能。微管在細胞分裂前期聚合成為紡錘體，而紡錘體在細胞有絲分裂過程中牽引染色體向兩極移動進入至兩個子細胞中

2、，從而完成細胞增殖。由于微管在細胞有絲分裂過程中承擔(dān)的重要作用，微管蛋白逐漸成為醫(yī)藥工作者研究與開發(fā)抗癌藥物的重要靶點之一，而以微管蛋白為靶點的微管蛋白抑制劑也已成為臨床證實有效的抗腫瘤藥物。該類抑制劑的作用機制是在快速分裂的腫瘤細胞中，通過抑制微管蛋白的聚合或者促進微管蛋白的聚合而干擾細胞的有絲分裂過程，使細胞有絲分裂中斷，停滯于M期，從而導(dǎo)致腫瘤細胞發(fā)生凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　 根據(jù)作用機制的不同，微管蛋白抑制劑可分為兩

3、大類:①抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚劑，如秋水仙堿類和長春堿類化合物;②促進微管蛋白聚合的微管蛋白聚合劑，如紫杉醇及其類似物，埃博霉素及其類似物。根據(jù)微管蛋白抑制劑在微管蛋白上的作用位點的不同，微管蛋白抑制劑又可分為3種類型:①作用于秋水仙堿位點的微管蛋白抑制劑;②作用于長春堿位點的微管蛋白抑制劑;③作用于紫杉醇位點的微管蛋白抑制劑。目前，長春堿和紫杉醇位點微管蛋白抑制劑類藥物已在腫瘤臨床治療方面占據(jù)了重要地位，紫杉醇更是已成為肺癌、

4、乳腺癌和卵巢癌的重要一線治療藥物。然而，和其他抗腫瘤藥物一樣，難以耐受的副作用及用藥后耐藥性的出現(xiàn)限制了微管蛋白抑制劑的臨床使用。因此，開發(fā)新型的具有更強活性、更低毒性、并且對多藥耐藥腫瘤細胞更有效的新型微管蛋白抑制劑具有很大的應(yīng)用前景。
　　 HA14-1是本博士論文作者的導(dǎo)師之一Ziwei Huang教授等研發(fā)的小分子化合物，是世界上第一例報道的Bcl-2抑制劑，能夠強有力地誘導(dǎo)乳腺、結(jié)直腸癌、腎癌、宮頸癌、腦膠質(zhì)瘤、白血病

5、等多種腫瘤細胞系發(fā)生凋亡。在后續(xù)的研究中，我們發(fā)現(xiàn)HA14-1不僅能夠通過誘導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生、細胞色素C釋放、半胱天冬酶Caspase-9/-3活化這一信號途徑而誘導(dǎo)凋亡，在其藥物濃度大于10μM時，還可以作用于微管蛋白秋水仙堿位點抑制微管蛋白聚合。將HA14-1作為母體藥物對其進行結(jié)構(gòu)改構(gòu)，設(shè)計并合成了一系列新型HA14-1類似物（2-amino-4-phenyl-4H-chromene-3-carboxylate analog

6、s），命名為mHA1-19，并對其中抗腫瘤活性較強的mHA1，6，11進行了后續(xù)的生物學(xué)評價和抗腫瘤機制研究。這些新型化合物表現(xiàn)出更強的抗腫瘤活性和更好的穩(wěn)定性。腫瘤細胞在接受藥物處理后逐漸出現(xiàn)包括細胞變長、不對稱及出現(xiàn)長偽足等細胞形態(tài)學(xué)改變，與HA14-1處理細胞后迅速表現(xiàn)出細胞縮小、核固縮、凋亡小體出現(xiàn)等細胞凋亡的典型改變截然不同。這些現(xiàn)象均提示這一系列HA14-1類似物有著不同于母體藥物HA14-1的腫瘤細胞殺傷機制，維持細胞正常

7、形態(tài)的微管蛋白極有可能是其主要作用靶點。雖然秋水仙堿類藥物因為毒性較大目前還暫未用于腫瘤治療，但秋水仙堿位點作為一個很有前景的腫瘤藥物靶標一直備受關(guān)注，目前已有多個化合物進入了臨床研究。研究及闡明這一系列mHA類似物的作用靶點及其抗腫瘤機制，將推動新型、高效的秋水仙堿位點抑制劑的設(shè)計和開發(fā)，具有重要意義。
　　 方法:
　　 1.化合物合成:該系列化合物總的合成路徑為采用苯甲醛、酚類似物和氰乙酸乙酯這三種組分和哌啶進行一

8、步化反應(yīng)合成?；衔锖铣珊缶?jīng)過核磁共振氫譜和質(zhì)譜驗證。
　　 (1)mHA1的制備3-溴-4，5-二甲氧基苯甲醛(0.49g，0.002mol)、3-二甲氨基苯酚(0.27g，0.002mol)、氰乙酸乙酯(0.21 mL，0.002 mol)和哌啶(0.4 mL，0.004 mol)溶于15ml無水乙醇，室溫下攪拌4小時。加入80ml二氯甲烷稀釋后用水清洗，硫酸鈉干燥化合物，過濾除去硫酸鈉，蒸發(fā)干燥溶劑。使用色譜分析法（己烷

9、/二氯甲烷）提純粗制品，得到0.6g mHA1，收益率63％。
　　 (2)mHA6的制備采用3-溴-4，5-二甲氧基苯甲醛、1-萘酚和氰乙酸乙酯作為原料，后續(xù)步驟同上，得到0.45g mHA6，收益率46％。
　　 (3)mHA11的制備采用3-氯苯甲醛、3-二甲氨基苯酚和氰乙酸乙酯作為原料，后續(xù)步驟同上，得到0.32g mHA11，收益率43％。
　　 2.細胞培養(yǎng):人白血病細胞HL-60/Bcl-2（pZi

10、p-Bcl-2質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染）惠贈于Dr.Kapil N.Bhalla（邁阿密大學(xué)醫(yī)學(xué)院，佛羅里達州，美國）。細胞培養(yǎng)條件為RPMI1640培養(yǎng)基，10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，5％二氧化碳，37℃。
　　 3.小鼠骨髓細胞收集小鼠骨髓細胞樣本來采樣于年齡為3月的C57BL/6雌性小鼠(Charles RiverLabs)。CO2吸入法處死小鼠，分離取出小鼠的脛骨和股骨，注射器吸取R

11、PMI1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗脛骨和股骨，將骨腔內(nèi)骨髓細胞沖洗出來，采用淋巴細胞分離法獲得小鼠骨髓細胞，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×105細胞。
　　 4.人正常骨髓細胞樣本收集在通過倫理委員會審查及獲得患者知情同意后，取得3例人正常骨髓細胞樣本。樣本均來自彌漫大B細胞淋巴瘤患者，已通過病理證實為正常骨髓。按骨髓穿刺術(shù)操作規(guī)范進行操作取得人體骨髓樣本，將肝素化的骨髓細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋后，采用淋巴細胞分離法獲得

12、人體骨髓細胞，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×105細胞。
　　 5.CellTiter-Blue法測定細胞活力HL-60/Bcl-2細胞或小鼠骨髓細胞接種于96孔板，分別接受不同濃度的mHAs藥物處理，溫箱孵育72小時后，采用CellTiter-Blue細胞活力檢測試劑盒按照使用說明測定細胞活力。
　　 6.Cell Count Kit-8(CCK-8)法測定細胞活力人骨髓細胞接種于96孔板，24小時后分別接受不同濃

13、度的mHAs藥物處理，溫箱孵育72小時后，采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒測定細胞活力。
　　 7.細胞集落形成實驗細胞接受不同濃度的mHAs藥物及DMSO對照處理24小時后，收集細胞，新鮮培養(yǎng)基稀釋后與甲基纖維素半固體培養(yǎng)基混合均勻，接入培養(yǎng)皿使每個培養(yǎng)皿內(nèi)細胞數(shù)目為200，體積為2ml。37℃，5％二氧化碳及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10-14天后倒置顯微鏡下計數(shù)細胞克隆數(shù)并計算細胞克隆形成率。
　　 8.細胞形態(tài)學(xué)檢測

14、1μM mHAs處理細胞24小時，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變并拍照。
　　 9.計算機分子模型采用微管和DAMA-秋水仙堿復(fù)合物中的微管晶體結(jié)構(gòu)(PDB:1SA0)作為模板，采用Autodock4程序來預(yù)測微管與配體mHA1，6，11的結(jié)合模型。
　　 10.秋水仙堿-微管蛋白競爭結(jié)合試驗1μM放射性標記的[3H]秋水仙堿，1％ DMSO和不同濃度的待測藥物均溶于50μl G-PEM緩沖液中，與1μM微管蛋白共同孵育1

15、小時，經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，采用液體閃爍法(Perkin-Elmer)測定濾液中放射性強度。使用GraphPadPrism對數(shù)據(jù)進行非線性回歸分析。
　　 11.微管蛋白聚合實驗按照試劑盒生產(chǎn)公司提供的說明書進行，將微管蛋白溶于G-PEM緩沖液中，得到濃度為3mg/ml的微管蛋白溶液，加入預(yù)先加入50μl待測藥物溶液的96孔板內(nèi)，50μl/孔，使用Synergy2酶標儀測定吸光度(360nm/420nm)，每分鐘一次，共測定

16、1小時。
　　 12.免疫熒光染色人肺癌細胞CRL5908經(jīng)1μM mHA1，6，11處理24h后，4％多聚甲醛4℃固定30分鐘，0.1％ Triton X-100透膜處理15min，2％ BSA封閉處理30min，1∶2000抗-α-微管蛋白單克隆抗體和7∶1000羅丹明-鬼筆環(huán)肽標記的抗肌動蛋白抗體避光處理細胞1h，1∶200抗鼠IgG二抗避光處理30min，1μg/ml DAPI處理1min。免疫熒光顯微鏡下觀察和拍照。<

17、br>　　 13.細胞周期測定1×106 HL-60/Bcl-2細胞分別接受1，3，5μM mHAs藥物處理24h。收集細胞，PBS清洗2次，重懸于100μl PBS和1ml75％預(yù)冷乙醇內(nèi)，-20℃過夜保存。測定當天離心細胞，移去上清，加入500μl PI染色液（含80μg/mL碘化丙啶，100μg/mL核糖核酸酶A，1％曲拉通），避光孵育至少半小時后流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowJo7.5軟件分析。
　　 14.DNA碎片分析方

18、法測定細胞凋亡1×106 HL-60/Bcl-2細胞分別接受不同藥物處理:DMSO對照、陽性對照0.1μM和1μM秋水仙堿，1μM和5μM mHA1，6，11，溫箱孵育24h，按照試劑盒生產(chǎn)公司提供的說明書進行提取每個處理組DNA，DNA經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，EB顯色照相。
　　 結(jié)果:
　　 1.mHA系列化合物細胞毒性測定:測定mHA1-19對人白血病細胞HL-60/Bcl-2的細胞毒性并計算其IC50，結(jié)果顯示該系

19、列化合物中mHA1，6，11具有較強的抗腫瘤活性，選擇這3種化合物進行后續(xù)的生物學(xué)評價和抗腫瘤機制研究。
　　 2.mHA系列化合物構(gòu)效分析:對該系列化合物進行構(gòu)效分析，發(fā)現(xiàn)C6位點上連接二甲氨基與苯基對化合物活性的影響類似但優(yōu)于羥基，羥基優(yōu)于氨基;mHA7，15，17活性均很差，提示C7位點添加任何基團均會降低化合物的活性。
　　 3.mHA1，6，11抗腫瘤活性明顯強于其母體藥物HA14-1:分別用不同濃度的HA14

20、-1和mHA1，6，11處理人白血病HL-60/Bcl-2細胞，24h或72h后測定細胞活力，結(jié)果顯示mHA1，6，11的IC50均小于1μM，而HA14-1的IC50為9.394±0.18μM，mHA1，6，11抗腫瘤活性明顯強于其母體藥物HA14-1。
　　 4.mHA1，6，11對人白血病細胞具有較強細胞毒性，但對正常小鼠骨髓細胞毒性較低:分別對人白血病HL-60/Bcl-2細胞及正常小鼠骨髓細胞進行相同濃度的mHA1，6

21、，11藥物處理，72h后分別測定細胞活力。結(jié)果顯示1μM mHA1，6，11可以殺死約一半的腫瘤細胞，而1μM藥物處理對正常小鼠骨髓細胞幾乎無影響。
　　 5.mHA1，6，11對人正常骨髓細胞幾乎無毒性:采集人正常骨髓細胞進行不同濃度的mHA1，6，11藥物處理，72h后分別測定細胞活力。結(jié)果顯示3μM mHAs可殺死幾乎全部的惡性HL-60/Bcl-2細胞，而同樣處理對人正常骨髓細胞幾乎毫無影響。
　　 6.陽性對照

22、藥物秋水仙堿對正常小鼠骨髓細胞毒性較大:采用秋水仙堿位點代表藥物秋水仙堿作為陽性對照，對人白血病HL-60/Bcl-2細胞及正常小鼠骨髓細胞進行相同濃度藥物處理，72h后分別測定細胞活力，結(jié)果顯示秋水仙堿對腫瘤細胞及正常骨髓細胞均有較強的細胞毒性，盡管其IC50值在人白血病細胞中僅為33.5±3.5 nM，但藥物濃度在25nM時即可殺傷約30％的正常骨髓細胞。
　　 7.mHA1，6，11可誘導(dǎo)腫瘤細胞喪失克隆形成能力:人白血病

23、HL-60/Bcl-2細胞在接受藥物處理后培養(yǎng)10～14d后計數(shù)克隆形成數(shù)，計算所得IC50值低于細胞毒性試驗，提示藥物處理不僅能在72h內(nèi)迅速殺死腫瘤細胞，并可引起部分細胞喪失增殖能力及克隆形成能力。
　　 8.mHA1，6，11引起腫瘤細胞產(chǎn)生特殊形態(tài)改變:mHA1，6，11可引起腫瘤細胞產(chǎn)生特殊形態(tài)改變。人白血病HL-60/Bcl-2細胞由懸浮細胞典型的球體變?yōu)椴灰?guī)則形、細胞變長及出現(xiàn)長偽足;人肺癌CRL5908細胞則由貼

24、壁細胞典型的梭狀變?yōu)槎噙呅位蝾悎A形。
　　 9.計算機模擬對接研究顯示mHA1，6，11可結(jié)合于微管蛋白上的秋水仙堿位點:計算機模擬對接研究采用DAMA-秋水仙堿晶體結(jié)構(gòu)作為模板，模擬計算結(jié)果顯示mHA1，6，11與秋水仙堿均可結(jié)合于微管蛋白上的相同位點-秋水仙堿位點，mHA1，6和秋水仙堿結(jié)合模式相似而mHA11結(jié)合模式略有不同。
　　 10.秋水仙堿-微管蛋白競爭結(jié)合試驗證實了mHA1，6，11可與秋水仙堿競爭結(jié)合位

25、點:秋水仙堿-微管蛋白競爭結(jié)合試驗顯示mHA1，6，11可與放射性標記的秋水仙堿競爭結(jié)合位點，抑制其與微管蛋白結(jié)合，其作用呈劑量依賴性方式。
　　 11.微管蛋白聚合實驗顯示mHA1，6，11和秋水仙堿均可抑制微管蛋白聚合，紫杉醇可促進微管蛋白聚合:微管蛋白聚合實驗顯示紫杉醇可促進微管蛋白聚合，mHA1，6，11和秋水仙堿均可抑制微管蛋白聚合，證實mHA1，6，11具有強效的抗微管聚合作用。
　　 12.免疫熒光染色實驗

26、證實mHA1，6，11可降低細胞內(nèi)微管含量并破壞其網(wǎng)狀分布:人肺癌CRL5908細胞接受1μM mHA1，6，11處理24h后行免疫熒光檢測，顯示胞漿內(nèi)沿細胞長軸密集分布的微管變?yōu)閺浬⒎植?，且熒光強度明顯降低，提示細胞內(nèi)微管含量減少。
　　 13.mHA1，6，11可誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生G2/M細胞周期阻滯:人白血病HL-60/Bcl-2細胞在接受1μM mHA1，6，11藥物處理24h后經(jīng)流式細胞儀檢測證實細胞發(fā)生特異性G2/M細

27、胞周期阻滯。
　　 14.DNA碎片分析證實mHA1，6，11可誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡:mHA1，6，11及秋水仙堿處理人白血病HL-60/Bcl-2細胞24h后行DNA碎片分析，出現(xiàn)明顯的凋亡條帶，證實秋水仙堿及mHA1，6，11均可誘導(dǎo)人白血病HL-60/Bcl-2細胞發(fā)生凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究獲得了一系列HA14-1類似物并證實其為具有高效抗腫瘤活性的微管蛋白抑制劑。
　　 2.對該系

28、列化合物的構(gòu)效分析發(fā)現(xiàn)C6位點上連接二甲氨基與苯基類似但均優(yōu)于羥基，羥基優(yōu)于氨基;C7位點上不宜連接任何側(cè)鏈，為日后繼續(xù)研發(fā)新型微管蛋白抑制劑提供了設(shè)計思路。
　　 3.本研究結(jié)果證明了mHA1，6，11具有較強的腫瘤細胞殺傷作用，其IC50為納摩爾級別，大大優(yōu)于其母體藥物HA14-1，而且對正常細胞毒性較小，具有進一步研發(fā)成藥的可能性。
　　 4.計算機模擬對接研究及秋水仙堿-微管蛋白競爭結(jié)合實驗證實mHA1，6，11

29、均結(jié)合于微管蛋白上的秋水仙堿位點并可與秋水仙堿競爭結(jié)合位點，為作用于秋水仙堿位點的新型微管蛋白抑制劑。
　　 5.微管蛋白聚合實驗進一步證實mHA1，6，11與紫杉醇作用方式相反，與秋水仙堿作用方式一致，為促微管蛋白解聚劑。
　　 6.免疫熒光染色實驗顯示mHA1，6，11可降低細胞內(nèi)微管數(shù)量及破壞胞漿內(nèi)正常微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
　　 7.流式細胞儀細胞周期檢測及DNA碎片分析實驗證實mHA1，6，11通過阻滯腫瘤細胞