新型微管靶向抑制劑LL-01和LL-02抗腫瘤活性與機(jī)制研究.pdf

1、在全球范圍內(nèi)，由于其高發(fā)性和高致死性，癌癥已成為一個巨大的社會負(fù)擔(dān)。除手術(shù)、放療外，化療仍然是腫瘤治療的主要手段。微管是細(xì)胞骨架的主要組成成分，在真核細(xì)胞中必不可少。微管參與多種細(xì)胞過程，如維持細(xì)胞形態(tài)、參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂等。由于其在細(xì)胞，尤其是細(xì)胞分裂中的重要作用，微管常作為抗腫瘤藥物研究的靶點(diǎn)。根據(jù)與微管作用位點(diǎn)的不同，微管靶向抑制劑主要分為作用于紫杉醇位點(diǎn)、長春堿位點(diǎn)和秋水仙堿位點(diǎn)的微管靶向抑

2、制劑。盡管紫杉醇類和長春堿類微管靶向抑制劑廣泛用于臨床腫瘤治療，但是這類藥物經(jīng)常伴隨過敏性反應(yīng)、骨髓抑制、周圍神經(jīng)病變等副作用以及腫瘤的多藥耐藥現(xiàn)象。因此，新型小分子秋水仙堿類微管靶向抑制劑成為人們研究的熱點(diǎn)。LL-01和LL-02是通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)合成的靶向微管秋水仙堿位點(diǎn)的化合物。本課題主要研究LL-01和LL-02抗腫瘤活性及作用機(jī)制。
　　第一部分 LL-01抗非小細(xì)胞肺癌活性與機(jī)制研究
　　方法:采用MTT法

3、、克隆形成實(shí)驗(yàn)、臺盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)及裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)來評價LL-01對非小細(xì)胞肺癌的增殖抑制作用。體外微管聚合實(shí)驗(yàn)及免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測LL-01對微管聚合的影響。PI單染法檢測LL-01對A549細(xì)胞周期分布的影響。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測LL-01對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。Western blotting法檢測LL-01對A549細(xì)胞中cyclinB1、p-cdc2、cleaved caspase

4、-3和cleaved PARP表達(dá)水平的影響。小管形成實(shí)驗(yàn)檢測LL-01對血管形成的影響。
　　結(jié)果:LL-01可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌體內(nèi)外增殖，且無明顯毒性。LL-01體外能夠抑制微管蛋白聚合，并可破壞A549細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)。LL-01可誘導(dǎo)A549細(xì)胞G2/M期阻滯，并能調(diào)節(jié)G2/M期相關(guān)蛋白cyclin B1和p-cdc2的表達(dá)。LL-01可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，并能提高cleaved caspase-3和cleavedP

5、ARP的表達(dá)水平。此外，LL-01能有效抑制小管形成，并呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　結(jié)論:新型微管靶向抑制劑LL-01能有效抑制非小細(xì)胞肺癌體內(nèi)外增殖，其作用機(jī)制與靶向微管破壞微管動力學(xué)從而誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯及凋亡有關(guān)。此外，LL-01還具有良好的抗血管生成活性。因此，LL-01有潛力成為抗非小細(xì)胞肺癌的候選藥物。
　　第二部分 LL-02抗白血病活性與機(jī)制研究
　　方法:MTT法評價LL-02對一系列腫瘤細(xì)胞的增殖抑制

6、作用，并選取白血病細(xì)胞K562進(jìn)行后續(xù)研究。體外微管聚合實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)微管聚合實(shí)驗(yàn)檢測LL-02對微管聚合的影響。PI單染法檢測LL-02對K562細(xì)胞周期分布的影響。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測LL-02對K562細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。小管形成實(shí)驗(yàn)檢測LL-02對血管形成的影響。
　　結(jié)果:LL-02對一系列腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，半數(shù)抑制率在19-102nmol/L之間，并以時間劑量依賴性方式抑制白血病細(xì)