3LL-GM腫瘤疫苗的抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、本研究擬以C57BL/6小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株3LL建立腫瘤動(dòng)物模型,從體內(nèi)和體外探討GM-CSF轉(zhuǎn)染的腫瘤疫苗3LL-GM是否能夠通過誘導(dǎo)增強(qiáng)的抗腫瘤免疫應(yīng)答,最終使得巨大腫瘤完全消退。更進(jìn)一步,通過對腫瘤細(xì)胞3LL-GM的腫瘤抑癌基因TSLC1表達(dá)檢測和由其免疫后誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞亞群比例和功能測定,對3LL-GM腫瘤疫苗的作用機(jī)制進(jìn)行探討,為臨床應(yīng)用GM-CSF腫瘤疫苗提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分 3LL-

2、GM荷瘤小鼠的腫瘤自發(fā)性完全消退
　　 3LL-GM是以lentivirus載體轉(zhuǎn)染小鼠GM-CSF基因的3LL細(xì)胞株,我們以其作為細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染獲得的全瘤活細(xì)胞疫苗,希望能夠藉此獲得特異性抗腫瘤效應(yīng)。
　　 以3LL-GM為實(shí)驗(yàn)組,以母本3LL和轉(zhuǎn)染空lentivirus載體的3LL-GFP為對照組,在小鼠右側(cè)腹股溝皮下注射5×1053LL、3LL-GFP或3LL-GM,每2-3天測量腫瘤大小,觀察荷瘤小鼠生存情況。

3、
　　 為排除3LL-GM荷瘤小鼠的腫瘤完全消退是由于GM-CSF基因的轉(zhuǎn)入導(dǎo)致的腫瘤生長特性改變所致,我們對3LL-GM在體內(nèi)與體外的生長特性進(jìn)行了檢驗(yàn)。我們首先觀察了普通體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長曲線,發(fā)現(xiàn)3LL、3LL-GFP或3LL-GM三株細(xì)胞的生長速率一致,可見GM-CSF的轉(zhuǎn)入沒有影響細(xì)胞本身的體外生長特性。體內(nèi),我們采用缺乏T淋巴細(xì)胞的裸鼠進(jìn)行3LL、3LL.GFP和3LI.-GM成瘤實(shí)驗(yàn)。將5×1053LL、

4、3LL-GFP和3LL-GM分別接種于裸鼠右腹股溝皮下,觀測腫瘤生長情況。
　　 進(jìn)一步,以各淋巴細(xì)胞亞群的特異性抗體體內(nèi)阻斷T淋巴細(xì)胞的功能,尋找在3LL-GM誘導(dǎo)的荷瘤小鼠腫瘤消退中起關(guān)鍵作用的T細(xì)胞亞群。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用同型抗體處理的對照組荷瘤小鼠的腫瘤發(fā)生消退,全部小鼠長期存活；而在用抗CD8抗體去除相應(yīng)的CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的情況下,小鼠的腫瘤消退現(xiàn)象消失,呈現(xiàn)進(jìn)行性生長,直至小鼠死亡,提示CD8+T細(xì)胞在3LL-GM的

5、抗腫瘤效應(yīng)中起了決定性作用。
　　 第二部分 3LL-GM腫瘤疫苗誘導(dǎo)增強(qiáng)的特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)
　　 承接上一部分的研究,我們在這部分中主要關(guān)注3LL-GM腫瘤疫苗在C57BL/6小鼠體內(nèi)誘生的特異性免疫應(yīng)答及效應(yīng)。
　　 首先,以流式細(xì)胞術(shù)觀察小鼠各淋巴細(xì)胞亞群的比例變化,發(fā)現(xiàn)在3LL-GM組小鼠的CD3+的脾臟T淋巴細(xì)胞中,CD8+T細(xì)胞比例為51.02％,顯著高于3LL組的39.43％和3LL-GFP組的

6、36.90％。以CD62Llow作為代表淋巴細(xì)胞活化、效應(yīng)的標(biāo)志,檢測了3LL-GM腫瘤疫苗接種對小鼠淋巴細(xì)胞活化狀態(tài)的影響。結(jié)果顯示,3LL-GM組小鼠脾臟CD3+CD62Llow細(xì)胞比例為2.73％,高于3LL組的1.73％和3LL-GFP組的1.59％,表明3LL-GM誘導(dǎo)機(jī)體T淋巴細(xì)胞處于活化和效應(yīng)狀態(tài)。由于機(jī)體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)的主要是CD8+T細(xì)胞,我們又檢測了脾臟淋巴細(xì)胞中CD8+CD62Llow細(xì)胞的比例,發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞

7、在3LL-GM組小鼠為1.18％,高于3LL組的0.70％和3LL-GFP組的0.58％?？梢?3LL-GM誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生系統(tǒng)性的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答以及淋巴細(xì)胞活化。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞,在維持免疫耐受,抑制免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用。在腫瘤免疫中,CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)控腫瘤免疫應(yīng)答,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。
　　 接著,我們體外檢測3LL-GM荷瘤小鼠誘生

8、的細(xì)胞免疫應(yīng)答。荷瘤第8天小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外以3LL細(xì)胞裂解液刺激,48小時(shí)后檢測特異性淋巴細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示:3LL-GM組淋巴細(xì)胞對3LL的特異性增殖顯著高于3LL組和3LL-GFP組(刺激指數(shù)SI值8.80 vs 3.84,2.72),表明3LL-GM荷瘤小鼠的免疫細(xì)胞誘導(dǎo)并顯著增強(qiáng)抗3LL腫瘤細(xì)胞的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　 進(jìn)一步檢測增強(qiáng)的3LL腫瘤特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答是否誘生增強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)。以流式細(xì)胞術(shù)對CD

9、8+T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ分泌檢測發(fā)現(xiàn),3LL-GM組小鼠CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力優(yōu)于3LL組和3LL-GFP組小鼠分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞(0.25％ vs 0.12％,0.10％),提示3LL-GM實(shí)驗(yàn)組誘生更多CD8+T效應(yīng)細(xì)胞被活化。小鼠體內(nèi)的IFN-γ分泌也獲得相同的結(jié)果。荷瘤第8天,3LL-GM組小鼠血清中IFN-γ濃度為4586.06pg/ml,與3LL組的320.49pg/ml相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。更重

10、要的是,在腫瘤局部,3LL-GM組小鼠腫瘤組織中IFN-γ的含量為39.12ng,顯著高于3LL組的2.18ng,充分表明3LL-GM組在腫瘤局部誘生了具有顯著殺傷效應(yīng)的CD8+T細(xì)胞,非常有利于對腫瘤細(xì)胞的殺傷。
　　 同時(shí),我們以ELISA方法研究3LL-GM實(shí)驗(yàn)組對荷瘤小鼠Th1/Th2免疫格局的影響,收獲的荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)12h后,檢測其上清中IFN-Yγ和IL-4的含量。結(jié)果顯示:3LL-GM組上清中的IFN-

11、γ明顯高于3LL組和3LL-GFP組(1408.97pg/ml vs 68.19pg/ml,53.80pg/ml),具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而三組間IL-4的含量則無明顯差異,表明3LL-GM腫瘤疫苗誘導(dǎo)的是Th1型應(yīng)答。
　　 第三部分 3LL-GM腫瘤疫苗抗瘤效應(yīng)的可能機(jī)制研究
　　 在這一部分中,我們探討了3LL-GM腫瘤疫苗抗瘤效應(yīng)的可能機(jī)制。
　　 首先,從分子和細(xì)胞水平對3LL、3LL-GFP和3LL-

12、GM細(xì)胞株GM-CSF的表達(dá)及分泌進(jìn)行了檢測。RT-PCR和PCR結(jié)果顯示,在mRNA水平,僅有3LL-GM表達(dá)GM-CSF。細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA結(jié)果顯示,3LL-GM分泌的GM-CSF為234.20ng/106/24h,而3LL和3LL-GFP不分泌GM-CSF,表明我們所培養(yǎng)的3LL-GM可以穩(wěn)定分泌GM-CSF。
　　 對小鼠體內(nèi)GM-CSF的表達(dá)情況進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察。3LL-GM組小鼠血清中GM-CSF濃度隨腫瘤面積增長

13、而上升,至腫瘤面積最大的荷瘤第8天,GM-CSF濃度達(dá)到最高,為1830.293pg/ml,而后又隨腫瘤消退過程而逐漸消失,而3LL荷瘤小鼠血清中始終未能檢測到GM-CSF。尤其是在腫瘤局部,3LL-GM組荷瘤小鼠的腫瘤組織表達(dá)高劑量的GM-CSF,荷瘤第8天最高,其勻漿液中含GM-CSF565.26ng/g腫瘤組織；3LL腫瘤勻漿液中僅含GM-CSF 0.50ng/g腫瘤組織,可能為腫瘤局部浸潤的免疫細(xì)胞所分泌。
　　 GM-

14、CSF在3LL-GM腫瘤局部的高濃度存在,有利于促進(jìn)DC成熟促進(jìn)特異性抗腫瘤免疫。I-Ab和CD80的高表達(dá)是DC成熟的標(biāo)志,對各組小鼠脾臟和TILs中DC成熟度進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,脾臟中,CD11c+I-Ab+細(xì)胞在3LL-GM組為20.05％,顯著高于3LL組的7.98％和3LL-GFP組的11.16％；CD80+細(xì)胞則為25.44％,顯著高于3LL組的4.80％和3LL-GFP組的18.81％。3LL-GM組的TILs中,CD11

15、c+I-Ab+細(xì)胞達(dá)60.62％,顯著高于3LL組的33.12％和3LL-GFP組的19.98％；CD80+細(xì)胞則為60.93％,高于3LL組的37.47％和3LL-GFP組的47.03％。這些結(jié)果都提示3LL-GM腫瘤疫苗能誘導(dǎo)全身特別是腫瘤局部DC的成熟。
　　 已知成熟DC有不同亞群,根據(jù)CD4和CD8α的表達(dá)情況,DC至少可被分為3個(gè)亞群,即CD8α+CD4-、CD8α-CD4+和CD8α-CD4-。有研究發(fā)現(xiàn),CD8α

16、+CD4-的DC能在體內(nèi)激活CTL。我們對3LL-GM腫瘤疫苗誘導(dǎo)的DC亞群進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,3LL-GM組的CD11c+CD8α+CD4-細(xì)胞比例顯著升高,特別是在腫瘤組織局部,高達(dá)55.35％,提示在3LL-GM腫瘤疫苗誘導(dǎo)的強(qiáng)烈的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答中,CD8α+CD4-這一DC亞群比例的升高可能起了至關(guān)重要的作用。
　　 已知DC分泌IL-12的能力與其誘導(dǎo)Th1型應(yīng)答有關(guān)。將DC體外培養(yǎng)后檢測上清中IL-12p40的

17、含量,發(fā)現(xiàn)3LL-GM組小鼠IL-12p40的分泌量為415.23pg/ml,與3LL組的142.53pg/ml和3LL-GFP組的156.98pg/ml相比有顯著性差異,說明3LL-GM腫瘤疫苗能誘導(dǎo)DC的功能增強(qiáng)。
　　 除了3LL-GM腫瘤疫苗誘導(dǎo)腫瘤局部微環(huán)境改變,促使DC成熟和誘導(dǎo)CD11c+CD8α+CD4-亞群以外,我們也嘗試探索了3LL-GM腫瘤本身生長特性的改變情況。
　　 TSLC1是一種最早發(fā)現(xiàn)于肺

18、腺癌細(xì)胞株A549的抑癌基因,與腫瘤的侵襲能力及死亡率有關(guān)。我們對3LL、3LL-GFP和3LL-GM的TSLC1基因表達(dá)進(jìn)行了檢測。RT-PCR和PCR方法顯示,3LL-GM在mRNA水平有高水平的TSLC1表達(dá),3LL和3LL-GFP則無。提示GM-CSF的轉(zhuǎn)入可能引起與腫瘤消退相關(guān)的基因表達(dá)的改變。
　　 進(jìn)一步對腫瘤原位的凋亡情況進(jìn)行檢測。在小鼠接種3LL或3LL-GM的第5天、第8天、第10天處死小鼠,取新鮮腫瘤組織固