基于腫瘤抗原的納米疫苗制備、評(píng)價(jià)及抗腫瘤效果研究.pdf

1、目的:盡管全腫瘤細(xì)胞裂解物已經(jīng)被作為腫瘤抗原的來源用于癌癥疫苗的研發(fā)，但是目前基于腫瘤細(xì)胞裂解物制備樹突狀細(xì)胞疫苗的抗腫瘤免疫治療的臨床試驗(yàn)結(jié)果不容樂觀。腫瘤細(xì)胞裂解物作為腫瘤抗原制備腫瘤免疫治療疫苗的療效尚有較大的改進(jìn)空間。因此，通過這種方式制備的腫瘤疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)的新技術(shù)和方法有待進(jìn)一步增強(qiáng)。為了改善基于腫瘤細(xì)胞裂解物疫苗的治療效果，生物材料在提高抗原遞送和提呈等方面具有很重要的作用。本研究構(gòu)建了一種以殼聚糖納米粒為基礎(chǔ)，

2、具有甘露糖受體靶向的新型還原響應(yīng)多糖納米載體，通過靜電吸附作用實(shí)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞裂解物結(jié)合形成納米粒疫苗，能夠有效提呈腫瘤抗原和活化T細(xì)胞，并通過引入靶向樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)的官能基團(tuán)和佐劑增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性以及機(jī)體對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答效果。
　　方法:首先將殼聚糖與腫瘤細(xì)胞裂解物通過靜電吸附方式結(jié)合，同時(shí)合成甘露糖修飾的海藻酸鈉(Man-ALG)，通過靜電吸附方式與殼聚糖負(fù)載的腫瘤細(xì)胞裂解物結(jié)合形成納

3、米粒疫苗制備甘露糖修飾的殼聚糖負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物納米粒(Man-CTS-TCL NPs)。通過核磁共振氫譜(1H-NMR)和紅外光譜(IR)來表征化學(xué)結(jié)構(gòu)，透射電鏡(TEM)確定結(jié)構(gòu);利用BCA法測(cè)定在不同的pH值下Man-CTS-TCL NPs中蛋白的釋放情況;CCK-8法以及LDH法評(píng)價(jià)納米粒對(duì)骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BMDC)的毒性;通過激光共聚焦以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMDC對(duì)Man-CTS-TCL NPs的攝取并進(jìn)行定性和定量分析;

4、體內(nèi)外評(píng)價(jià)Man-CTS-TCLNPs對(duì)骨髓來源的樹突狀細(xì)胞促成熟能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)與BMDC成熟相關(guān)的表面標(biāo)志的表達(dá)情況，ELISA法檢測(cè)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的分泌情況;利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)考察皮下注射Man-CTS-TCL NPs后其在體內(nèi)的分布情況以及向回流淋巴結(jié)的遷移能力;通過三種不同的動(dòng)物模型（預(yù)防性模型、治療性模型以及肺轉(zhuǎn)移模型）來研究這種新型的納米粒疫苗的抗腫瘤效應(yīng)，并探討其作用機(jī)制。
　　結(jié)果:成功地制備了Man-

5、CTS-TCL NPs納米疫苗，并通過1H-NMR和IR確定了其結(jié)構(gòu)。TEM結(jié)果顯示Man-CTS-TCL NPs具有特征性的球型結(jié)構(gòu)，在pH為5.0時(shí)能夠更持久的釋放抗原。殼聚糖負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物納米粒(CTS-TCL NPs)和Man-CTS-TCL NPs可以有效地被BMDC細(xì)胞攝取，毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Man-CTS-TCL NPs具有良好的生物學(xué)相容性。Man-CTS-TCL NPs組的細(xì)胞攝取明顯增加，體內(nèi)更具有抗原提呈細(xì)胞靶向

6、性，皮下注射后24h主要分布在回流淋巴結(jié)。Man-CTS-TCL NPs可以增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志CD80、CD86、CCR7、MHCⅠ、MHCⅡ以及CD40的表達(dá)，相應(yīng)的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4等的表達(dá)也上調(diào)。預(yù)防性動(dòng)物模型結(jié)果顯示，免疫的納米粒疫苗組小鼠能夠延緩腫瘤的出現(xiàn)，具有較好的抑制腫瘤生長(zhǎng)效果。治療性動(dòng)物模型結(jié)果顯示，與其他組相比，Man-CTS-TCL NPs治療組，腫瘤的體積以及重量明顯的減小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。荷瘤小鼠

7、用納米粒疫苗免疫后，具有增強(qiáng)的CTL反應(yīng)，且小鼠體內(nèi)的抗TCL特異性抗IgG抗體水平也顯著提高，小鼠血清中IFN-γ的分泌明顯增強(qiáng)。荷瘤鼠肺部轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示，Man-CTS-TCL NPs通過尾靜脈注射后，能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞向肺部的轉(zhuǎn)移情況，這種效果可能是通過活化小鼠外周血中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用來完成的。
　　結(jié)論:總之，成功的制備了殼聚糖納米粒，構(gòu)建了甘露糖修飾的殼聚糖納米粒負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物疫苗，這種疫苗具有較低的