納米雄黃抗腫瘤作用機理研究.pdf

1、目前，隨著雄黃在腫瘤治療中的應(yīng)用日益為人們所關(guān)注，使得提高其生物利用度，降低毒副作用等問題迫切需要解決。在本研究中，我們考慮對雄黃進行納米化處理以提高其生物利用度，分別對納米雄黃的粉碎、炮制以及固體分散體制備工藝進行了系統(tǒng)的研究，并以白血病HL-60細(xì)胞為模型，研究了納米雄黃對腫瘤細(xì)胞增殖的影響及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，同時考察了納米雄黃對細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、胞內(nèi)谷胱甘肽氧化還原水平以及膜毒性。完成的工作包括以下幾個方面：（1）分別對納米雄

2、黃的粉碎、炮制以及固體分散體制備工藝進行了系統(tǒng)地研究。使用行星式高能球磨機，400r/min，濕法研磨，研磨6h即可得到粒徑為327.4nm、多分散指數(shù)為0.312的納米雄黃粉。TEM、SEM分析顯示該粉體顆粒形狀不規(guī)則，有一定程度的團聚，經(jīng)超聲分散可有效消除此團聚現(xiàn)象。對所制納米雄黃粉分別進行了酸洗、堿洗、水洗以及水飛處理，干燥方法采取自然干燥或醇洗干燥，結(jié)果表明水飛醇洗干燥工藝可有效去除As2O3，防止團聚。以As2O3含量和均一性

3、為指標(biāo)，通過正交實驗篩選納米雄黃固體分散體制備工藝，得出最佳工藝條件為：雄黃：PEG=1:5；攪拌時間：30min；攪拌溫度：70±5℃。并以As2O3含量和微觀形貌為指標(biāo)考察了納米雄黃固體分散劑的化學(xué)和物理穩(wěn)定性，結(jié)果表明，在暴露的30d內(nèi)，粒子可保持較好的化學(xué)物理穩(wěn)定性。（2）為了進一步確證納米生物效應(yīng)，排除本底As2O3可能的貢獻(xiàn)，制備了具有相同As2O3本底濃度的原料雄黃與納米雄黃分散體，同時設(shè)以As2O3本底濃度加藥組，通過細(xì)

4、胞計數(shù)及噻唑藍(lán)（MTT）方法研究了三者對HL-60細(xì)胞增殖的影響，同時應(yīng)用熒光顯微鏡、瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)及RT-PCR技術(shù)研究其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果表明納米雄黃可明顯抑制細(xì)胞生長，降低存活率，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞核的濃縮以及典型的“DNAladder”電泳條帶和較高的凋亡率，且細(xì)胞周期分析結(jié)果表明納米雄黃主要阻滯細(xì)胞生長于G0/G1期。細(xì)胞經(jīng)rhodamine123熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)測定發(fā)現(xiàn)，納米雄黃可顯

5、著降低細(xì)胞線粒體膜電位。采用RT-PCR技術(shù)測定了與線粒體介導(dǎo)的凋亡密切相關(guān)的Bcl-2與Bax等相關(guān)蛋白基因mRNA水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米雄黃可顯著抑制Bcl-2蛋白基因mRNA水平，而對Bax影響不明顯。另外，根據(jù)納米雄黃固體分散體和原料雄黃固體分散體的體外氧化動力學(xué)（PBS緩沖溶液中，37℃，5﹪CO2）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者的氧化速率明顯高于后者的。以上結(jié)果表明納米雄黃較原料雄黃表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞生長抑制和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，且在此過程中，納米

6、雄黃可能是通過釋放可溶性砷來發(fā)揮其細(xì)胞毒作用的。（3）應(yīng)用DCFH-DA熒光標(biāo)記熒光分光光度法及TBARs、DNPH和DTNB比色法分別研究了納米雄黃對胞內(nèi)活性氧水平、膜脂質(zhì)過氧化程度、蛋白質(zhì)羰基和還原型巰基含量的影響，結(jié)果表明，伴隨胞內(nèi)活性氧水平的提高，納米雄黃組細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度和蛋白質(zhì)氧化程度尤其是蛋白質(zhì)還原型巰基的氧化明顯加劇。根據(jù)抗氧化酶活性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米雄黃作用細(xì)胞36h，可顯著抑制CAT酶活性，刺激SOD（總SOD和

7、MnSOD）與GPx酶活性顯著提高，對GR、GST和TR等酶活性影響不大。進一步通過RT-PCR技術(shù)考察納米雄黃作用下MnSOD與GPxmRNA水平變化發(fā)現(xiàn)二者mRNA水平均無顯著性改變。以上結(jié)果表明納米雄黃可引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，其可能作為凋亡發(fā)生的一個促發(fā)因子。（4）通過OPT熒光標(biāo)記，考察整個暴露過程中GSH與GSSG含量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米雄黃作用細(xì)胞12h后，可引起胞內(nèi)GSH的大量耗竭，GSSG的大量積累，而在隨后的2

8、4h內(nèi)，納米雄黃組細(xì)胞一直保持較高水平的GSH和GSSG。提示納米雄黃可通過破壞胞內(nèi)谷胱甘肽氧化還原水平發(fā)揮其細(xì)胞毒作用。（5）研究了納米雄黃對細(xì)胞膜通透性、膜流動性以及膜蛋白等生物大分子構(gòu)象的影響。結(jié)果表明，納米雄黃處理細(xì)胞，可顯著增加膜通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)LDH的大量漏出，引起膜流動性的降低，破壞膜蛋白尤其是膜表面蛋白結(jié)構(gòu)。另外，納米雄黃組細(xì)胞紅外譜圖也給出了與其凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)一致的酰胺Ⅰ/酰胺Ⅱ面積積分比值提高與核酸/酰胺Ⅱ面積積分比值