基于報告基因靶向NF-κB通路的抑制劑篩選及抗腫瘤活性研究.pdf

1、結(jié)腸癌是危害人類健康的主要惡性腫瘤之一，結(jié)腸癌在與癌癥相關(guān)的死亡中是第二大致死性疾病。近年來隨著飲食結(jié)構(gòu)的變化，其發(fā)病率逐漸上升，同時發(fā)病趨向年輕化。近年來結(jié)腸癌的化學(xué)治療雖然有了迅速的發(fā)展，臨床療效和安全性也得到很大的提高，但生存期延長不明顯以及藥物不良反應(yīng)大等問題仍未有突破，因此，尋求新的治療策略成為近些年來的研究重點。研究認(rèn)為，NF-κB參與調(diào)控多種凋亡和增生相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　NF-κ

2、B是一種廣泛分布于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子。在細(xì)胞處于靜息狀態(tài)下，轉(zhuǎn)錄因子以P50、P65和IκB異源三聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到外界信號刺激處于激活狀態(tài)時，IκB蛋白，即NF-κB抑制蛋白，發(fā)生磷酸化、泛素化、被蛋白酶體降解。p50和p65被釋放轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核中，結(jié)合特定的DNA序列，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。
　　本文利用熒光素酶報告基因技術(shù)成功建立基于報告基因靶向NF-κB通路的抑制劑篩選模型，并進(jìn)行待測化合物靶向NF-κB通

3、路的評價，成功篩選出靶向NF-κB通路的化合物雷公藤甲素衍生物(LLDT-246)。借助免疫印跡等生物學(xué)檢測方法評價其對NF-κB信號通路相關(guān)分子的影響，并探究其抗腫瘤活性及初步探討誘導(dǎo)NF-κB通路作用機(jī)制。
　　一、基于報告基因靶向NF-κB通路的抑制劑篩選成功建立基于報告基因靶向NF-κB通路的抑制劑篩選模型，并經(jīng)過陽性藥NF-(κ)B特異性抑制劑PDTC對模型的驗證。利用模型對大量待測化合物進(jìn)行靶向NF-KB通路的篩選，篩

4、選出對LPS誘導(dǎo)的NF-κB具有較強(qiáng)抑制活性的化合物。
　　二、雷公藤甲素衍生物L(fēng)LDT-246對NF-(κ)B信號通路相關(guān)分子的影響雷公藤甲素衍生物L(fēng)LDT-246能夠抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中誘導(dǎo)型及組成型的NF-κB的活性，抑制IκB的磷酸化，但對IκB表達(dá)無影響，抑制TNF-α誘導(dǎo)的p65轉(zhuǎn)運入核，劑量依賴性抑制NF-κB下游靶蛋白(Cyclin D1、Mcl-1、Bcl-2)的表達(dá)，進(jìn)一步驗證了LLDT-246對NF-

5、κB的靶向抑制作用。
　　三、雷公藤甲素衍生物L(fēng)LDT-246的抗腫瘤活性及靶向NF-κB通路機(jī)制初探SRB法檢測結(jié)果顯示，LLDT-246對HCT116、HT-29兩株結(jié)腸癌細(xì)胞均有較強(qiáng)的生長抑制作用，說明LLDT-246在體外具有較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LLDT-246可以引起HCT116細(xì)胞中Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切，推測，線粒體凋亡途徑是LLDT-246介導(dǎo)HCT116細(xì)胞毒作

6、用的一種重要途徑。并且LLDT-246與TNF-α聯(lián)合給藥對三株結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡都具有協(xié)同作用。LLDT-246誘導(dǎo)NF-κB通路機(jī)制可能跟其抑制經(jīng)典的PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，進(jìn)而抑制下游p-GSK3β、p-mTOR的活性;LLDT-246還可以抑制p-STAT3，p-STAT3也是一個與炎癥有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，STAT3在細(xì)胞內(nèi)與NF-κB相互作用，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。LLDT-246對HCT116細(xì)胞中p-JNK、p-

7、ERK的表達(dá)無明顯作用。
　　本論文綜合利用現(xiàn)代藥理學(xué)和分子生物學(xué)檢測方法，成功建立基于報告基因靶向NF-κB通路的抑制劑篩選模型，發(fā)現(xiàn)具有靶向抑制NF-κB通路的化合物，并對其中活性較好的雷公藤甲素衍生物L(fēng)LDT-246進(jìn)行靶向NF-κB通路的研究，結(jié)果表明LLDT-246可以抑制組成型及誘導(dǎo)型NF-κB活性，對三株結(jié)腸癌細(xì)胞系具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，且對正常細(xì)胞毒性較小，并初步探討了LLDT-246靶向NF-κB通路的分子機(jī)制，