Survivin和Op18的新型雙重化學抑制劑GDP366抗腫瘤活性及其機制研究.pdf

1、Survivin基因是由DC.Altirei克隆的抗凋亡基因，在細胞生存和細胞周期進程中發(fā)揮著重要作用。Survivin主要功能包括抑制凋亡和調控細胞周期。Survivin屬于IAP家族，該家族還包括XIAP，cIAP1，cIAP2，NIAP，ML-IAP和apollon。IAP家族成員通過桿狀病毒IAP重復結構域與caspase(pro-caspase-9，caspase-3 andcaspase-7)發(fā)生直接或間接作用來抑制凋亡。另

2、一方面，Survivin與內著絲粒蛋白(inner centromere protein)，Aurora B激酶和Borealin一起組成染色體過客復合蛋白體，指導姐妹染色單體的精確分離，調控有絲分裂晚期微管的穩(wěn)定性，促進細胞增殖。
　　 在胚胎形成時期，Survivin大量表達，與正常的細胞分裂和組織分化相適應。在終末分化的組織中，Survivin一般很難檢測到。但在腫瘤形成過程中，Survivin異常高表達。在多種人類腫瘤中

3、，Survivin的表達量與腫瘤不良預后及高復發(fā)率呈正相關相關。目前認為，Survivin過度表達可導致腫瘤對多種化療藥物產(chǎn)生耐受。此外，利用特異的反義寡核苷酸靶向干擾Survivin的表達能夠有效殺傷腫瘤細胞。因此，Survivin作為腫瘤治療中最具腫瘤特異性的靶點之一受到科學家的密切關注?？茖W家們運用不同策略靶向干擾Survivin的表達或其功能，曾嘗試運用結合Survivin的啟動子(如小分子化合物YM155)，抑制mRNA穩(wěn)定性

4、(如反義寡核苷酸和siRNA)，或干擾其功能(如Survivin顯性負突變株)以達到殺傷腫瘤的效果。
　　 Op18(癌蛋白18)，也稱Stathmin，是普遍表達于真核細胞的一種微管調節(jié)蛋白，其表達水平在不同組織細胞中差異較大。最初，Op18作為一種微管失穩(wěn)蛋白被鑒定出來，它能精確地調節(jié)有絲分裂紡錘體的結構和功能，且在多種惡性腫瘤細胞高度表達，如白血病，乳腺癌和卵巢癌等。這些都提示我們Op18在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，

5、是一個有潛在價值的腫瘤標志，可作為腫瘤治療的新靶點。但迄今為止，Op18的化學抑制劑尚未有報道。
　　 為了篩選新型的Survivin抑制劑，我們建立了一個小規(guī)模的化合物庫并發(fā)現(xiàn)小分子化合物GDP366能同時抑制Survivin和Op18/stathmin的表達。本課題通過觀察小分子化合物GDP366對腫瘤細胞生長的影響，對其抑制腫瘤細胞生長的機制進行了探索，并以此為契機，進一步探討了Survivin和Op18這兩個蛋白分子在調

6、控細胞分裂中的作用，為腫瘤靶向治療提供了新的思路，同時也為該化合物作為一種新型的化療藥物進入臨床實驗奠定了理論基礎。
　　 主要研究方法和結果：
　　 1. GDP366選擇性抑制Survivin和Op18/stathmin的表達。HCT116細胞用GDP366以遞增的濃度處理48小時或一固定濃度(2.0μM)處理不同的時間，Western blotting分析表明Survivin和Op18表達減少，并呈劑量和時間依賴關

7、系。半定量RT-PCR的結果證實Survivin和Op18的mRNA水平受到明顯抑制。
　　 2.GDP366抑制Survivin和Op18/stathmin的表達不依賴于p53和p21的水平。用GDP366處理48小時后，將HCT116 p53-/-細胞，HCT116 p21+/+細胞和HCT116p21-/-細胞進行Western blotting分析。結果證實，在HCT116 p53-/-細胞和HCT116p21-/-細胞

8、中GDP366仍以劑量依賴的關系降低Survivin和Op18的表達，表明了GDP366對Survivin和Op18的抑制作用不依賴于p53和p21的狀態(tài)。
　　 3.GDP366在體外抑制腫瘤細胞生長和腫瘤細胞克隆形成。HCT116細胞用GDP366處理48小時，改用新的無藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10天后，檢測細胞克隆形成數(shù)目。結果表明，GDP366以劑量依賴關系抑制HCT116細胞克隆形成數(shù)，其IC50大約是1.0μM.。p53或

9、p21缺失及野生型的HCT116細胞用GDP366處理72小時后，用羅丹明B檢測細胞活性。結果顯示，各種細胞均呈現(xiàn)劑量依賴的生長抑制效應，其IC50分布在1.0-2.0μM的水平。這些結果表明p53和p21表達與否，GDP366都能抑制腫瘤細胞的生長。
　　 4.GDP366抑制荷瘤裸鼠模型的腫瘤生長。我們采用裸鼠接種腫瘤模型進一步檢測了GDP366對腫瘤細胞的體內效應。實驗表明GDP366在不引起小鼠發(fā)病或死亡的劑量下可有效抑

10、制皮下接種HCT116腫瘤的生長(P＜0.05)，腫瘤體積及重量明顯減小。
　　 5.GDP366誘導腫瘤多核細胞形成及中心體擴增，微核形成，且誘導多倍體產(chǎn)生而不依賴于p53和p21水平。細胞免疫熒光，共聚焦及電鏡的結果均表明GDP366可誘導細胞體積變大，多個核的形成，中心體的擴增及微核的產(chǎn)生。流式細胞儀分析細胞周期表明GDP366可誘導細胞G2/M期延長及之后多倍體的產(chǎn)生，該現(xiàn)象可以持續(xù)72-96小時。將HCT116 p53

11、+/+和HCT116p53-/-細胞，HCT116p21+/+和HCT116p21-/-細胞對GDP366的反應進行比較，證實了GDP366誘導多倍體的產(chǎn)生不依賴于p53和p21的狀態(tài)。
　　 6.GDP366誘導腫瘤細胞染色體不穩(wěn)定性。HCT116細胞用2.0μM的GDP366處理不同時間后將其染色體提取并檢測，發(fā)現(xiàn)染色體異常(包括染色體中斷和缺口)的細胞比例呈現(xiàn)時間依賴關系的增高。Western blotting結果顯示GD

12、P366呈劑量-時間關系誘導HCT116細胞產(chǎn)生γH2AX，并誘導Chk1Ser317和Chk2 Thr68位點磷酸化水平的增高。
　　 7.GDP366通過抑制端粒酶活性誘導細胞衰老。HCT116細胞經(jīng)GDP366處理48-72小時后，可觀察到表達胞漿衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的衰老樣表型細胞增加。此外，TRAP檢測法發(fā)現(xiàn)，GDP366明顯抑制了端粒酶活性。
　　 8.GDP366抑制微管蛋白聚合及腫瘤

13、細胞的遷移能力。對分別經(jīng)GDP366，紫杉醇和長春新堿處理的HCT116細胞提取微管蛋白單體及二聚體的成分進行Western blotting分析。對照組細胞，解聚與聚合的微管蛋白的比例大約為1∶1，長春新堿處理的細胞組(陰性對照)比例大于1。相反，紫杉醇處理的細胞組(陽性對照)比例明顯降低。GDP366處理后的細胞，這個比例也明顯降低，表明了GDP366可顯著抑制微管蛋白的解聚。用劃痕實驗初步證明GDP366處理24小時后能抑制腫瘤細

14、胞的遷移。
　　 結論及研究意義：
　　 該研究中，我們鑒定出小分子化合物GDP366，它能有效并選擇性抑制Survivin和Op18的表達，這種抑制作用表現(xiàn)在蛋白和轉錄水平。盡管GDP366可引起p53和p21水平顯著增高，但對Survivin和Op18抑制作用并不依賴于p53和p21的狀態(tài)。相應地，GDP366抑制微管蛋白的聚合，誘導多種腫瘤細胞多倍體的形成，同樣不依賴于p53和p21的水平。GDP366在體內和體外