抗新生血管生成肽ES-2的殼寡糖化修飾及其抗新生血管生成活性研究.pdf

1、內(nèi)皮抑素（Endostatin，ES）是從一種從小鼠內(nèi)皮細(xì)胞瘤上清中分離純化獲得的內(nèi)源性新生血管生成抑制劑，可通過抑制腫瘤組織新生血管的生成，實(shí)現(xiàn)對腫瘤營養(yǎng)供給途徑和廢物代謝途徑的切斷，從而起到抗腫瘤的作用。ES結(jié)構(gòu)中有一短肽段（IVRRADRAAVP，ES-2）同樣具有明顯的抗新生血管生成活性，且更容易通過固相合成的方式獲得。但ES-2也存在體內(nèi)半衰期較短和穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，其應(yīng)用受到了很大的限制。研究表明，通過化學(xué)修飾的手段有望改善其

2、這些缺點(diǎn)。
　　殼寡糖具有一定的抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移活性、具一定靶向性且結(jié)構(gòu)明確，季銨化后的殼寡糖水溶性及帶正電荷的能力更佳。故本課題采用6-O-季銨化殼寡糖（6-O-2′-hydroxylpropyltrimethyl ammoniumchloride chitosan oligosaccharide，O-HTCCOS）對ES-2的末端羧基進(jìn)行了化學(xué)修飾，獲得了6-O-季銨化殼寡糖-ES-2修飾物（O-HTCCOS-ES-2），經(jīng)研

3、究發(fā)現(xiàn)，該結(jié)合物既保留了較高的抗新生血管生成活性，又整合了殼寡糖的良好特性，使其具有穩(wěn)定性高、靶向性強(qiáng)和細(xì)胞親和性強(qiáng)等特性。本課題研究內(nèi)容和取得的主要成果如下：
　　1.6-O-季銨化殼寡糖（O-HTCCOS）的合成與表征
　　經(jīng)過三步化學(xué)反應(yīng)在殼寡糖C6位的羥基上引入季銨鹽側(cè)鏈，后經(jīng)透析并冷凍干燥得到水溶性更好的季銨化殼寡糖，產(chǎn)率為95.26％。通過IR和1H NMR分析表征，O-HTCCOS結(jié)構(gòu)與預(yù)期結(jié)構(gòu)相符。茚三酮比色

4、法測定6-O-季銨化殼寡糖的自由氨基率為87.35％。
　　2.6-O季銨化殼寡糖-ES-2肽修飾物（O-HTCCOS-ES-2）的合成與表征
　　以EDC/NHS作為交聯(lián)劑，通過兩步反應(yīng)由ES-2肽分子上的羧基與O-HTCCOS分子的氨基通過酰胺鍵結(jié)合實(shí)現(xiàn)對ES-2的末端羧基的結(jié)構(gòu)修飾，修飾率超過50％。采用SephadexG-25凝膠層析柱進(jìn)行分離純化，最終獲得了O-HTCCOS-ES-2純品。通過MALDI-TOF-M

5、S質(zhì)譜分析鑒定表明ES-2通過-CO-NH-被O-HTCCOS修飾，且ES-2與O-HTCCOS連接比例為1：1，即一分子ES-2被一分子O-HTCCOS修飾。
　　3.O-HTCCOS-ES-2的熱穩(wěn)定性研究
　　分別研究了O-HTCCOS-ES-2、ES-2在25℃和37℃環(huán)境中放置相同時(shí)間后對內(nèi)皮細(xì)胞抑制能力的變化情況，從而比較二者的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，O-HTCCOS-ES-2的熱穩(wěn)定性優(yōu)于ES-2。
　　4.O

6、-HTCCOS-ES-2的細(xì)胞親和性研究
　　流式細(xì)胞術(shù)研究結(jié)果表明，與ES-2相比，O-HTCCOS-ES-2對內(nèi)皮細(xì)胞的親和性更強(qiáng)，更加易于進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。
　　5.O-HTCCOS-ES-2的體內(nèi)外生物活性研究
　　5.1.O-HTCCOS-ES-2的抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用研究
　?。?）CCK-8法檢測抗細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度梯度的O-HTCCOS-ES-2、ES-2以及兩者混合物在作用48 h后，

7、均可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，其中O-HTCCOS-ES-2作用效果明顯優(yōu)于ES-2或O-HTCCOS與ES-2混合物。且該抑制作用呈現(xiàn)出一定的藥物濃度依賴性。
　?。?）管腔形成實(shí)驗(yàn)測定體外抗新生血管生成活性結(jié)果表明，不同濃度梯度的O-HTCCOS-ES-2、ES-2以及O-HTCCOS和ES-2混合物分別作用6 h后，O-HTCCOS-ES-2修飾物的抗新生血管生成作用效果明顯比ES-2以及兩者混合物要強(qiáng)很多，且抗新生血管作用效果

8、具有藥物濃度依賴性。
　　5.2.O-HTCCOS-ES-2的體內(nèi)抗新生血管生成活性研究
　?。?）雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，O-HTCCOS-ES-2、ES-2以及O-HTCCOS和ES-2的混合物三種藥物對雞胚絨毛尿囊膜血管生成均有一定的抑制作用，血管數(shù)量和其分支都有一定的減少，但O-HTCCOS-ES-2的抗新生血管生成作用效果優(yōu)于ES-2以及混合物，且體內(nèi)抗新生血管生成作用效果隨著藥物濃度的增大而加強(qiáng)。
　　

9、（2）斑馬魚模型體節(jié)血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，O-HTCCOS-ES-2,ES-2以及兩者混合物均可抑制斑馬魚體節(jié)間新生血管的生成，且其中O-HTCCOS-ES-2的抗新生血管生成作用為最佳。
　　5.3.O-HTCCOS-ES-2的抗細(xì)胞遷移作用研究
　　劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法測定抗細(xì)胞遷移的抑制作用的兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，O-HTCCOS-ES-2、ES-2以及兩者混合物均可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，其中O-HTCCOS