利凡諾抗血管生成作用及其機制初探.pdf

1、目的：觀察利凡諾對來源于內(nèi)胚層的肝細胞（BRL-3A）、來源于中胚層人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HuVEC）和成纖維細胞（L929）的生長增殖能力的影響；對利凡諾抗血管生成的作用及機制進行初步探討。
　　 方法：借助倒置顯微鏡觀察細胞在經(jīng)不同藥物濃度（3.13μg·ml-1，6.25μg·ml-1，12.5μgml-1）、不同作用時間處理后，細胞的形態(tài)學(xué)改變，同時在熒光顯微鏡下觀察細胞中利凡諾的熒光強度。用噻唑藍法（MTT）以及核仁組織區(qū)

2、銀染法（AgNOR）檢測利凡諾作用后，各細胞的生存和增殖能力的改變。用雞胚尿囊膜實驗（CAM）檢測利凡諾對活體組織血管生成的影響。流式細胞術(shù)檢測了利凡諾作用后對HuVEC細胞凋亡及周期的影響。運用RT-PCR，免疫細胞化學(xué)及Western blotting的方法分別從mRNA水平和蛋白表達水平觀察利凡諾作用后HuVEC的VEGF及VEGFR2表達影響。
　　 結(jié)果：細胞學(xué)觀察：利凡諾作用24h后，肝細胞（BRL-3A）以及成纖維

3、細胞（L929）的形態(tài)無明顯變化，人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HuVEC）突起變細甚至消失，細胞生長速度變慢；伴隨藥物濃度的增大，單位面積細胞數(shù)逐漸減少；三種細胞內(nèi)利凡諾自發(fā)熒光隨著藥物濃度的加大和時間延長，熒光趨強。MTT結(jié)果：顯示利凡諾對三種細胞的增殖都有一定的抑制作用，其中對HuVEC細胞增殖能力的抑制強于另外兩種細胞（HuVEC vsBRL-3A，P<0.001；HuVEC vs L929，P<0.001）。在不同濃度利凡諾作用下，內(nèi)皮細

4、胞核仁組織區(qū)減少幅度較另外兩種細胞更加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。雞胚尿囊膜實驗顯示利凡諾在體內(nèi)也有顯著的抑制血管生成作用，6.25μg·ml-1、12.5μg·ml-1用藥組與NaCl組相比有顯著差異。流式細胞術(shù)：利凡諾作用后對HuVEC細胞的凋亡無顯著影響（P>0.05）。RT-PCR顯示隨著利凡諾用藥濃度的增加，HuVEC細胞VEGF及VEGFR2的mRNA表達逐漸降低。免疫細胞化學(xué)方法查見：利凡諾作用4

5、8小時后，HuVEC細胞內(nèi)VEGFR2隨著利凡諾用藥濃度的增加而降低。Western blotting檢測HuVEC細胞內(nèi)VEGFR2蛋白表達的變化趨勢同免疫組化一致，隨用藥濃度的增高，蛋白表達降低。結(jié)論：利凡諾對來源不同胚層的三種細胞的增殖能力均有抑制作用，其中對HuVEC細胞的抑制尤其顯著，提示該藥對內(nèi)皮細胞生長增殖的抑制較為特異。利凡諾能通過降低內(nèi)皮細胞的VEGF及VEGFR2的mRNA表達，抑制VEGFR2的蛋白表達，而發(fā)揮抗血