基于轉(zhuǎn)基因斑馬魚抗血管生成中藥活性成分篩選及其作用機(jī)制研究.pdf

1、課題背景:隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高，疾病譜也發(fā)生了改變。感染性疾病負(fù)擔(dān)減輕，而包括惡性腫瘤在內(nèi)的慢性非感染性疾病和傷害逐漸成為發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家的疾病主要負(fù)擔(dān)。據(jù)中國(guó)腫瘤登記中心所提供資料顯示:我國(guó)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年增加，我國(guó)城市居民主要疾病死亡率位居首位的是惡性腫瘤，惡性腫瘤已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康的疾病之一。
　　 目前，手術(shù)、化療、放療是臨床上治療腫瘤的基本方法，但副作用嚴(yán)重，療效欠佳，預(yù)后差且價(jià)格

2、昂貴。因此，研制開發(fā)防治腫瘤的藥物已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　 隨著對(duì)腫瘤研究的深入，發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移均依賴于新生血管的長(zhǎng)入，來(lái)為腫瘤的增長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)。腫瘤新生血管的形成是以血管生成的方式發(fā)生的，若能夠抑制腫瘤組織的血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，勢(shì)必可以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的目的，因此，“抗血管生成療法”或“饑餓療法”很快被提出并成為一種治療腫瘤的新方法。近年來(lái)，一些體外研究實(shí)驗(yàn)均顯示，抑制腫瘤細(xì)胞

3、新生血管的形成，可達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。2004年FDA批準(zhǔn)抗血管生成藥物貝伐單抗，用于治療結(jié)直腸癌，可有效的延長(zhǎng)病人的生存期。這些研究均證實(shí)抗血管生療法治療腫瘤的科學(xué)性和有效性。
　　 血管生成是一個(gè)受眾多生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的復(fù)雜的生理、病理過(guò)程，在這些生長(zhǎng)因子中，VEGF是目前已知作用最強(qiáng)、專屬性最高的促血管生長(zhǎng)因子，它能夠增加血管通透性，促進(jìn)腫瘤血管形成，對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移發(fā)揮重要作用，以VEGF及其受體作用途

4、徑中的任一環(huán)節(jié)為靶點(diǎn)，阻斷VEGF對(duì)腫瘤血管的作用，都可以達(dá)到遏制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的目的，所以，VEGF及其受體是研究血管生成抑制劑作用機(jī)制的基本靶點(diǎn)。
　　 中醫(yī)中藥治療疾?。ò[瘤）有上千年的歷史，積累了豐富的臨床資料，而且我國(guó)中藥資源廣博，因此，從天然藥物尤其是傳統(tǒng)中藥中尋找安全有效的腫瘤血管生成抑制劑是新藥研發(fā)領(lǐng)域的重要課題和全新方向。
　　 近年來(lái)，斑馬魚因具有養(yǎng)殖和繁殖容易、胚胎發(fā)育迅速等生物學(xué)特點(diǎn)，逐漸被用

5、于篩選抗血管生成藥物，其具有以下獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):①高通量（相對(duì)于其他體內(nèi)試驗(yàn)）、操作簡(jiǎn)單。②篩選周期短。斑馬魚的胚胎發(fā)育速度快，24-72小時(shí)即可得到試驗(yàn)結(jié)果。③胚胎透明、易觀察。斑馬魚的胚胎是透明的，很容易觀察其活體狀態(tài)下器官發(fā)育、血管生成情況。④樣品用量少，且為活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。⑤用藥簡(jiǎn)單。待測(cè)化合物可以直接溶于水中并擴(kuò)散到胚胎中，也可直接注射到胚胎。⑥與人類具有高度相關(guān)性，篩選準(zhǔn)確率高。⑦成本低。斑馬魚的飼養(yǎng)、繁殖成本遠(yuǎn)低于其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

6、
　　 近年來(lái)有研究表明:人參皂苷Rg3、姜黃素、去甲斑蝥素、羥基紅花黃色素A、青蒿琥酯、靛玉紅具有抗血管生成的作用。這些中藥活性成分除斑馬魚模型外在其它模型上證實(shí)有抗血管生成作用，考慮到在斑馬魚模型上其發(fā)生抗血管生成效果的可能性更大，因此選用了這六種中藥活性成分。本研究以轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎為動(dòng)物模型，利用體視熒光顯微鏡觀察中藥活性成分對(duì)其體節(jié)間血管生成抑制效果，從分子生物學(xué)角度初步研究抗血管生成機(jī)制，同時(shí)為斑馬魚抗血管生成中藥活

7、性成分篩選的適用性和可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、選用帶有血管內(nèi)皮細(xì)胞或者其前體細(xì)胞的特異性標(biāo)記物fli1的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(tgfli1∶eGFP)為篩選藥物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。篩選前一天，挑選tgfli1∶ eGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚純合子和AB野生型斑馬魚放于交配盒中，第二天早晨光照刺激產(chǎn)卵，收集半小時(shí)內(nèi)的胚胎放于盛有胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置于28.5℃孵化箱培養(yǎng)。當(dāng)胚胎發(fā)育至10hpf時(shí)轉(zhuǎn)移至盛有胚胎培養(yǎng)液的2

8、4孔板中，每個(gè)孔放入10個(gè)胚胎備用。胚胎發(fā)育至12hpf時(shí)，將配置好的藥液依次加入24孔板中。每種藥液分高、中、低個(gè)三個(gè)濃度。選擇初步有抑制血管生成效果的藥液及其濃度，每種藥液濃度平行5個(gè)孔重復(fù)實(shí)驗(yàn)。于同一培養(yǎng)板中，留出2列孔，1列加陽(yáng)性對(duì)照藥物(SU5416)，1列不予加藥，1列DMSO組。中藥活性成分均用二甲基亞砜(DMSO)溶解。胚胎發(fā)育至48hpf,用OLYMPUS MVX10體式熒光顯微鏡觀察。挑選抗血管生成有效中藥的胚胎指標(biāo)

9、如下:與同時(shí)期野生型AB斑馬魚胚胎相比大體形態(tài)發(fā)育正常;fli1基因熒光表達(dá)強(qiáng)度減弱、缺失或者血管熒光分布紊亂等熒光表達(dá)異常的胚胎。
　　 2、針對(duì)篩選有效的目標(biāo)單體，進(jìn)行初步機(jī)制研究。首先利用整體原位雜交(WISH)的方法，初步預(yù)測(cè)（定性）其flk1 mRNA的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分正常組和試驗(yàn)組，收集48hpf斑馬魚胚胎（方法同前），體視熒光顯微鏡觀察拍照。然后利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法，定量分析其flk

10、1 mRNA表達(dá)規(guī)律，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分處理組和空白對(duì)照組，收集48hpf斑馬魚胚胎（方法同前）。PCR產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)捕獲圖像，利用BandScan5.0軟件獲得具體數(shù)據(jù)。
　　 3、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差表示。多個(gè)樣本均數(shù)間的比較用單因素方差分析。使用One-Way ANOVA分析后，若方差不齊，使用近似F檢驗(yàn)的Welch法和Brown-Forsythe法，然后運(yùn)用基于方差不齊的多重比較方法Dunne

11、t'ts T3和Dunnet'ts C。以上數(shù)據(jù)均用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性水平P＜0.01。
　　 主要結(jié)果:
　　 1、中藥活性成分篩選結(jié)果：(1)人參皂苷Rg3、姜黃素?zé)o明顯抑制血管生成效果，其中人參皂苷Rg3濃度0.02～0.16μg/μl時(shí)，斑馬魚均于24hpf死亡，姜黃素0.016～0.064μg/μl時(shí)，每組中有8條斑馬魚死亡。但二者小于死亡濃度時(shí)，對(duì)血管亦無(wú)抑制作用。(2)去甲斑蝥素，未觀察到

12、抑制血管效果，一定濃度對(duì)斑馬魚有毒性，濃度在0.025μg/μl就會(huì)發(fā)生死亡。(3)羥基紅花黃色素A，當(dāng)濃度達(dá)到8μg/μl～10μg/μl，魚尚未發(fā)生死亡(48hpf)，但脊柱有輕度彎曲，多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，僅觀察到有一條魚血管比較清晰，仔細(xì)觀察，抑制血管不明顯。所以效果甚微。(4)青蒿琥酯:0.5～1μg/μl時(shí)，斑馬魚在28hpf均死亡，0.01、0.05、0.1在72hpf均未破膜，手動(dòng)破膜后，斑馬魚脊柱屈曲，血管有抑制，但不顯著，且

13、有死亡跡象。(5)靛玉紅，100μM時(shí)，魚胚胎出現(xiàn)畸形死亡，15、30、90μM，其抑制血管的程度逐漸加重，但其發(fā)育正常，10條斑馬魚中有8條發(fā)生不同程度的抑制血管作用。
　　 2、青蒿琥酯對(duì)斑馬魚體節(jié)間血管生成的觀察二甲基亞砜組與空白對(duì)照組相比，體節(jié)間血管長(zhǎng)度無(wú)差異;與空白對(duì)照組相比，青蒿琥酯各劑量組有差異，但并不顯著，未顯示劑量依賴性。
　　 3、靛玉紅對(duì)斑馬魚胚胎體節(jié)間血管生成的觀察二甲基亞砜組與空白對(duì)照組相比，體

14、節(jié)間血管長(zhǎng)度無(wú)差異;與空白對(duì)照組相比，靛玉紅各劑量組體節(jié)間血管長(zhǎng)度有顯著性差異，且呈劑量依賴性抑制。
　　 4、青蒿琥酯對(duì)tgfli1∶ eGFP斑馬魚胚胎flk1基因表達(dá)的影響與空白對(duì)照組相比，青蒿琥酯處理組的基因信號(hào)減少，但不顯著;與空白對(duì)照組比，青蒿琥酯低劑量組無(wú)顯著差異，青蒿琥酯中、高劑量組有顯著差異。
　　 5、靛玉紅對(duì)tgfli1∶ eGFP斑馬魚胚胎flk1基因表達(dá)的影響與空白對(duì)照組相比，靛玉紅處理組的基因

15、信號(hào)顯著減少;靛玉紅對(duì)斑馬魚胚胎的flk1mRNA的表達(dá)水平有明顯的抑制作用，并隨濃度的增高而增加，與空白對(duì)照組相比，有顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 1、斑馬魚具有體積小、胚胎透明、繁殖速度快等優(yōu)勢(shì)。本研究選用的tgfli1∶eGFP斑馬魚是將GFP（綠色熒光蛋白）標(biāo)記插入到fli1基因的啟動(dòng)子序列中，得到了在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，在熒光顯微鏡下就可以清晰地觀察和定量分析藥物對(duì)血管生成的影響。研究

16、表明，此模型較人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、雞胚尿囊膜模型更簡(jiǎn)便易行，適用于中藥抗血管生成活性成分篩選。
　　 2、六種中藥活性成分抗血管生成觀察結(jié)果提示:除青蒿琥酯、靛玉紅外，其余四種單體無(wú)明顯抑制斑馬魚胚胎血管生成效果，且有致畸、發(fā)育遲緩、毒性等作用。靛玉紅抑制斑馬魚體節(jié)血管生成效果顯著，但濃度高于100μM，亦可致畸或致死。
　　 3、與空白對(duì)照組相比，青蒿琥酯、靛玉紅能夠抑制斑馬魚胚胎體節(jié)間血管生成，而且后者呈劑量依賴性。<

17、br>　　 4、WISH、RT-PCR結(jié)果顯示，青蒿琥酯處理的斑馬魚胚胎flk1mRNA的表達(dá)水平有較輕的抑制作用，且其抑制無(wú)明顯劑量依賴關(guān)系;靛玉紅處理的轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎的flk1mRNA顯著減少，且隨著藥物濃度的增加，flk1mRNA的表達(dá)隨之減少。提示:靛玉紅可能通過(guò)抑制VEGFR2與VEGF結(jié)合后的信號(hào)通路的某個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)阻斷胞內(nèi)蛋白磷酸化，從而影響VEGFR2基因的表達(dá)。
　　 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，通過(guò)