諾帝對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病視網(wǎng)膜血管生成的影響及作用機(jī)制.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabeticretinopathy,DR)的主要病理特征是微血管改變。由于氧化應(yīng)激的大量產(chǎn)生和血管生成是DR的重要的發(fā)病機(jī)制，抗氧化劑和抗血管生成在DR的治療研究中具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。我們既往研究表明，人工合成的脂氧化酶抑制劑諾帝(Nordy)能抑制體外惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，通過(guò)降低瘤細(xì)胞VEGF，bFGF等多種血管生成因子表達(dá)、抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移等方式抑制腫瘤血管生成治療惡性腫瘤。對(duì)于其在非腫瘤性血管生成性

2、疾病如DR和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用有待于進(jìn)一步研究。由于DR的微血管改變主要表現(xiàn)為活躍的血管生成，而諾帝具有抗氧化和抗血管生成作用，本研究擬從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)兩方面檢測(cè)諾帝對(duì)DR血管生成的作用并探討其可能的作用機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果包括： 1.諾帝對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠DR治療作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 采用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)一次性腹腔注射誘導(dǎo)的糖尿病SpragueDawley(SD)大鼠模型，將糖尿病大鼠隨

3、機(jī)分糖尿病組(10只)、生理鹽水注射組(10只)和諾帝注射組(10只)，另取10只正常大鼠設(shè)為正常對(duì)照組。諾帝注射組腹腔注射諾帝27mg/kg體重(隔日一次)治療糖尿病大鼠，正常對(duì)照組和生理鹽水注射組采用等量生理鹽水腹腔注射替代諾帝注射，糖尿病組則不作任何處理，分別在注射后1個(gè)月和3個(gè)月取材，利用透射電鏡及體視學(xué)定量等方法觀察諾帝注射對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管形態(tài)和毛細(xì)血管基底膜厚度的影響；采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)了諾帝腹腔注射對(duì)糖尿病大鼠

4、視網(wǎng)膜表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signaltransductionandactivatorsoftranscription-3,STAT3)以及磷酸化STAT3(

5、phosphorylatedSTAT3，p-STAT3)的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜光滑、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞無(wú)明顯形態(tài)改變；這些視網(wǎng)膜幾乎不表達(dá)VEGF、iNOS、STAT3和p-STAT3，而GFAP僅限于內(nèi)界膜有微弱表達(dá)。糖尿病組和生理鹽水注射組大鼠在1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)，毛細(xì)血管基底膜平均體積均較同期正常對(duì)照組增加(P＜0.01)。視網(wǎng)膜均能檢測(cè)到VEGF、iNOS、GFAP、STAT3和p-STA

6、T3陽(yáng)性表達(dá)；在1個(gè)月和3個(gè)月，VEGF和iNOS陽(yáng)性著色平均面積較同期正常對(duì)照組增加(P＜0.01)，而GFAP的陽(yáng)性著色平均面積僅在3個(gè)月時(shí)較正常對(duì)照組增加(P＜0.01)，從1個(gè)月到3個(gè)月，VEGF、iNOS、GFAP、STAT3和p-STAT3的陽(yáng)性著色信號(hào)均增強(qiáng)，到3個(gè)月時(shí)，VEGF、iNOS和GFAP陽(yáng)性著色幾乎貫穿于全視網(wǎng)膜。諾帝注射組大鼠在1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)，毛細(xì)血管基底膜平均體積較同期糖尿病組和生理鹽水注射組減少(P＜0

7、.01)；視網(wǎng)膜VEGF、iNOS、GFAP、STAT3和p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)均較同期糖尿病組和生理鹽水注射組呈不同程度的降低(P＜0.01)。 2.諾帝抑制內(nèi)皮細(xì)胞體外血管生成的觀測(cè) 利用50μg/ml糖基化牛血清白蛋白(advancedglycationbovineserumalbumin，AGE-BSA)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC)小管樣

8、結(jié)構(gòu)(tubule-likestructures，TLS)形成的體外血管生成模型，模擬糖尿病視網(wǎng)膜血管生成，用濃度為20μmol/L～200μmol/L的諾帝對(duì)這一模型進(jìn)行干預(yù)處理。采用MTT(波長(zhǎng)=570nm)比色分析和活細(xì)胞數(shù)量，用透射電鏡觀察諾帝對(duì)HUVEC形態(tài)的影響，用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)諾帝處理24h-72h時(shí)HUVEC表達(dá)iNOS、STAT3、p-STAT3、VEGF及其受體KDR的變化，用RT-PCR方法檢測(cè)諾帝處理后HUVE

9、C的VEGF和KDR基因表達(dá)的變化，用Westernblot方法進(jìn)一步檢測(cè)HUVEC表達(dá)STAT3和p-STAT3的變化。 結(jié)果顯示，25μg/ml-100μg/ml的AGE-BSA在24h-72h均能使培養(yǎng)的HUVEC數(shù)量增加，能誘導(dǎo)HUVEC在Ⅰ型膠原中形成TLS，其在Ⅰ型膠原表面形成的TLS長(zhǎng)度較同期的無(wú)AGE-BSA培養(yǎng)的HUVEC顯著增加(P＜0.01)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)見(jiàn)AGE-BSA培養(yǎng)條件下的HUVEC的S期和G2

10、/M期細(xì)胞所占的比例和增殖指數(shù)增加；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)這些HUVEC呈現(xiàn)iNOS、VEGF、KDR、STAT3和p-STAT3染色明顯陽(yáng)性，而無(wú)AGE-BSA存在下的HUVEC僅表達(dá)KDR。ELISA檢測(cè)見(jiàn)AGE-BSA培養(yǎng)的HUVEC的上清中VEGF濃度較無(wú)AGE-BSA培養(yǎng)的HUVEC顯著增加(P＜0.01)。RT-PCR能檢測(cè)到AGE-BSA培養(yǎng)的HUVEC有VEGF和KDR的mRNA表達(dá)。AGE-BSA的這些作用具有一定的時(shí)間和劑

11、量依賴性。采用20μmol/L-200μmol/L的諾帝處理50μg/mlAGE-BSA培養(yǎng)的HUVEC時(shí)發(fā)現(xiàn)，諾帝能抑制AGE-BSA所刺激的HUVEC增殖和S期與G2/M期細(xì)胞比例，抑制HUVEC的iNOS、VEGF、STAT3、p-STAT3和KDR的表達(dá)以及VEGF的分泌(P＜0.01)；Westernblot也證明諾帝對(duì)HUVEC的STAT3和p-STAT3表達(dá)有明顯抑制作用，但20μmol/L的諾帝處理的AGE-BSA培養(yǎng)H

12、UVEC的仍有STAT3和p-STAT3表達(dá)。 上述研究結(jié)果的主要結(jié)論如下： 1.諾帝具有抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)反應(yīng)性增生、毛細(xì)血管基底膜增厚，維持血-視網(wǎng)膜屏障功能穩(wěn)定的作用，并通過(guò)抑制VEGF和iNOS的表達(dá)而抗血管生成，從而減輕大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變。諾帝抑制STAT3/p-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是上述作用的機(jī)制之一。 2.諾帝對(duì)AGE-BSA激活的體外內(nèi)皮細(xì)胞血管生成表型(VEGF和KDR表達(dá)及TLS