紅松種殼組成及多酚提取分離與抗氧化抗腫瘤功能研究.pdf

1、紅松（Pinus koraiensis）廣泛分布于在我國(guó)東北地區(qū)，紅松種殼中富含多種活性成分，其中多酚類成分是重要的抗氧化劑，具有很大的開發(fā)潛力。本文系統(tǒng)地研究了紅松種殼中有效成分的組成及其中多酚成分的抗氧化活性及抗腫瘤作用途徑，為綜合開發(fā)及利用紅松種殼資源用于防治氧化損傷提供了理論基礎(chǔ)。
　　采用水蒸氣蒸餾法提取并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析松殼中的揮發(fā)性成分及多酚組成；利用分光光度法分析紅松種殼中活性成分的組成；采用超聲波輔助

2、法提取松殼多酚，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)結(jié)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化松殼多酚的提取工藝；選取大孔樹脂法純化松殼多酚并通過靜態(tài)及動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)優(yōu)化了工藝條件；通過建立體外模型研究了松殼多酚抑制生理性及非生理性自由基的作用，以及松殼多酚對(duì)鐵離子的鰲合作用和總還原能力；通過建立細(xì)胞、組織等體外模型研究松殼多酚抗氧化溶血的作用及抗脂質(zhì)過氧化的能力，深入研究了松殼多酚的抗氧化活性；建立動(dòng)物亞急性衰老模型及γ射線輻射模型，通過研究動(dòng)物的生理指標(biāo)及氧化相關(guān)酶的活性深入

3、探討松殼多酚抗氧化功能及其作用機(jī)制；通過 MTT比色法、集落形成試驗(yàn)法及瓊脂糖凝膠電泳法分別研究了松殼多酚對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化及凋亡的影響；采用免疫染色法研究了松殼多酚對(duì)細(xì)胞中原癌基因Bcl-2及Bax表達(dá)的影響并采用分光光度法測(cè)定了細(xì)胞中凋亡酶 caspase-9活力的變化；流式細(xì)胞法研究松殼多酚對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響，從而探索紅松種殼多酚抗腫瘤作用的途徑及機(jī)制；建立小鼠體內(nèi)的S180及 H22腹水瘤及實(shí)體瘤模型，用以研究松殼多酚提

4、取物的體內(nèi)抗腫瘤作用，并通過研究動(dòng)物血清中關(guān)鍵性的代謝酶活力的變化來探索松殼多酚在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用的途徑。
　　通過以上各項(xiàng)研究得到結(jié)果如下：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析出紅松種殼中的23種化學(xué)成分，其中酚類化合物為香芹酚、二叔丁基對(duì)甲基苯酚及6-叔丁基-2,4-二甲酚等；優(yōu)化得到的松殼多酚的最佳提取工藝為：提取時(shí)間2.80 h、料液比1:26（g/mL）、乙醇濃度43％、提取溫度80℃；優(yōu)化得到的松殼多酚最佳純化工藝為：采用AB

5、-8型大孔樹脂進(jìn)行吸附，上樣濃度1.5 mg/mL，上樣流速2.0 BV/h，以1.5 BV/h流速采用30%及70%乙醇進(jìn)行梯度洗脫。對(duì)松殼多酚抗氧化活性的研究結(jié)果顯示松殼多酚能夠有效的抑制羥自由基及超氧陰離子等生理性自由基，EC50值分別為0.391 mg/mL及4.37 mg/mL，松殼多酚還能夠明顯的清除DPPH及ABTS等非生理性自由基，EC50值分別為0.023 mg/mL及0.46 mg/mL。研究發(fā)現(xiàn)松殼多酚能夠顯著地抑

6、制紅細(xì)胞的氧化溶血并對(duì)肝勻漿及卵黃脂質(zhì)過氧化具有非常有效的抑制作用，其中對(duì)肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制率為91.50%（7.0 mg/mL），對(duì)卵黃過氧化的抑制率為95.44%（1.5 mg/mL）。
　　通過對(duì)松殼多酚體內(nèi)抗氧化作用的研究發(fā)現(xiàn)，松殼多酚能夠顯著地抑制小鼠的亞急性衰老反應(yīng)，中劑量組及大劑量組可以明顯提高小鼠腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）含量，提高谷胱甘肽（GSH）的含量。松殼多酚還能夠有效的抑

7、制及修復(fù)由γ射線輻射引起的氧化損傷。并且松殼多酚能夠有效的抑制 HT29（人結(jié)腸癌細(xì)胞）、H460（人肺癌細(xì)胞）、SCG7901（人胃癌細(xì)胞）及 MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞）腫瘤細(xì)胞的增殖，其中松殼多酚抑制 HT29細(xì)胞增殖的作用最為明顯。經(jīng)松殼多酚作用后 HT29細(xì)胞集落形成數(shù)明顯降低并且細(xì)胞的DNA發(fā)生裂解彌散現(xiàn)象，這說明松殼多酚具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化及凋亡的作用。
　　本研究發(fā)現(xiàn)松殼多酚的作用影響了腫瘤細(xì)胞中癌基因的表達(dá)及細(xì)胞周

8、期的進(jìn)程，研究發(fā)現(xiàn)松殼多酚具有下調(diào) HT29細(xì)胞中Bcl-2基因表達(dá)及上調(diào) Bax基因表達(dá)的作用，并且這種作用具有時(shí)間及劑量依賴性；同時(shí)松殼多酚的作用使HT29細(xì)胞中處于G1期的細(xì)胞百分率上升，說明松殼多酚對(duì)細(xì)胞G1期具有上調(diào)作用，而 S期細(xì)胞百分率下降，說明松殼多酚對(duì)細(xì)胞 S期具有下調(diào)作用，結(jié)果顯示松殼多酚的作用使細(xì)胞發(fā)生 G1/S期阻滯從而延緩了細(xì)胞從 G1期到S期的進(jìn)程，并且這種細(xì)胞周期阻滯作用呈現(xiàn)劑量依賴性；體內(nèi)抗腫瘤研究發(fā)現(xiàn)松