HBx蛋白對(duì)肝細(xì)胞癌Caveolin-1基因表達(dá)的調(diào)控及其分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的： 乙型肝炎病毒(HBV)感染在我國(guó)是肝細(xì)胞癌(HCC)的最主要致病原因。絕大部分HCC患者合并有HBV感染。HBV可促進(jìn)肝細(xì)胞惡變及侵襲、轉(zhuǎn)移。但是其作用機(jī)制尚不明確。乙肝病毒x基因(HBx)編碼的HBx蛋白具有強(qiáng)大的惡性轉(zhuǎn)化能力，可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的發(fā)生，并增加其惡性表型，導(dǎo)致腫瘤的預(yù)后不良。其中的一個(gè)機(jī)制為：HBx可以導(dǎo)致一些抑癌基因失活，從而使抑癌基因失去對(duì)細(xì)胞惡性表型轉(zhuǎn)化和侵襲、轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。

2、 我所前期的研究結(jié)果以及文獻(xiàn)報(bào)道均顯示，HBx可促進(jìn)癌基因c-Src蛋白的活化，但其機(jī)理尚不清楚。Caveolin-1作為一個(gè)候選抑癌基因，是c-Src蛋白活性調(diào)控的關(guān)鍵性抑制因子。推測(cè)其可能是上述過程中的一個(gè)重要中介因子。HBx是否對(duì)Caveolin-1有調(diào)控作用?通過查閱文獻(xiàn)，我們收集到以下信息：第一，DNA甲基化是抑癌基因在惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)的一個(gè)重要分子機(jī)制：第二，已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)Caveolin-1存在甲基化狀態(tài)；第三，包括

3、HBV在內(nèi)的多種病毒可誘導(dǎo)抑癌基因發(fā)生啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化，從而下調(diào)其表達(dá)?；谝陨侠碚?，我們得出假設(shè)：HBx有可能導(dǎo)致Caveolin-1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而下調(diào)Caveolin-1表達(dá)。本文重點(diǎn)是驗(yàn)證上述假設(shè)，探討HBx對(duì)Caveolin-1的調(diào)控及其分子機(jī)制。 材料與方法： 1.通過Real-Time PCR、免疫組化方法在123例臨床肝細(xì)胞癌組織中檢測(cè)Caveolin-1和HBx的表達(dá)，探討它們之

4、間以及與各臨床病理因素間的關(guān)聯(lián)；在不同侵襲、轉(zhuǎn)移潛能的同系肝癌細(xì)胞株MHCC-97L和MHCC-97H中，檢測(cè)其Caveolin-1表達(dá)，以明確其與侵襲、轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系； 2.利用Adeasy系統(tǒng)，構(gòu)建Caveolin-1重組腺病毒載體，用其轉(zhuǎn)染HepG-2肝癌細(xì)胞，通過Western-blot、侵襲實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)等方法，觀察過表達(dá)Caveolin-1對(duì)HCC活化型c-Src蛋白的表達(dá)調(diào)控作用，以及對(duì)其侵襲、運(yùn)動(dòng)能力的影響；

5、 3.用HBx重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721肝癌細(xì)胞，觀察HBx對(duì)Caveolin-1的調(diào)控作用；以巢式甲基化特異性PCR(n-MSP)方法結(jié)合測(cè)序檢測(cè)外源性HBx是否可引起Caveolin-1啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)高甲基化，并在合并HBV感染的HCC組織中檢測(cè)其Caveolin-1啟動(dòng)子甲基化情況； 4.由于Caveolin-1啟動(dòng)子序列中含有2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子SP1蛋白的特異性結(jié)合位點(diǎn)，而DNA甲基化可抑制SP1的轉(zhuǎn)錄激活

6、作用。我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建一系列序貫缺失5’端SP1結(jié)合位點(diǎn)的Caveolin-1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒，使其分別包含完整Caveolin-1啟動(dòng)子序列、缺失一個(gè)SP1轉(zhuǎn)錄元件和缺失全部?jī)蓚€(gè)SP1轉(zhuǎn)錄元件。通過螢蟲酶活性檢測(cè)分析，以明確轉(zhuǎn)染HBx基因?qū)τ贑aveolin-1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，并初步探討SP1轉(zhuǎn)錄元件在其中所起的作用； 5.DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)是DNA甲基化的主要催化酶。利用外源性轉(zhuǎn)染HBx基因，檢測(cè)SMMC-77

7、21細(xì)胞總DNMT活性以及其中有轉(zhuǎn)甲基活性的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA表達(dá)的變化，明確HBx對(duì)上述DNMT表達(dá)的影響；分別設(shè)計(jì)并構(gòu)建DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒，檢測(cè)并分析其螢蟲酶活性，探討HBx對(duì)上述基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。 結(jié)果及結(jié)論： 1.在臨床HCC組織標(biāo)本及不同侵襲、轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞中檢測(cè)Caveolin-1及HBx表達(dá)，我們得出如下結(jié)果： 1.1.C

8、aveolin-1的表達(dá)在HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌中明顯下調(diào)； 1.2.Caveolin-1的表達(dá)與大川、肝癌、AFP表達(dá)水平、大血管侵襲、腫瘤單發(fā)或多發(fā)和pTNM分期等臨床病理因素均呈顯著負(fù)相關(guān)。提示Caveolin-1表達(dá)與HCC的進(jìn)展有密切關(guān)系，其表達(dá)隨著腫瘤的進(jìn)展而下調(diào)； 1.3.在同系中分離出的不同侵襲、轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株中，高侵襲、轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株MHCC-97H中Caveolin-1的表達(dá)明顯低于低侵襲、轉(zhuǎn)移

9、潛能的MHCC-97L，提示了Caveolin-1的表達(dá)隨著腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)而下調(diào)； 1.4.Caveolin-1的表達(dá)與HBx表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，暗示著可能存在HBx下調(diào)Caveolin-1基因表達(dá)的機(jī)制。 2.成功構(gòu)建了攜帶Caveolin-1基因的重組腺病毒載體，并能夠高效轉(zhuǎn)染HepG-2肝癌細(xì)胞，目的基因得到高表達(dá)；外源性轉(zhuǎn)染Caveolin-1基因，可以抑制c-Src蛋白的活化，降低HepG-2肝癌細(xì)

10、胞的侵襲、運(yùn)動(dòng)能力。 3.HBx可以下調(diào)Caveolin-1基因的表達(dá)；33例HCC組織中84.8％(28/33)均存在Caveolin-1基因啟動(dòng)子區(qū)域部分甲基化，說明在合并HBV感染的HCC中，Caveolin-1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化是一個(gè)普遍存在的現(xiàn)象；HBx可引起SMMC-7721肝癌細(xì)胞Caveolin-1基因啟動(dòng)子區(qū)域部分CpG位點(diǎn)甲基化；去甲基化藥物5-Aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-2’-d

11、c)可恢復(fù)Caveolin-1基因的表達(dá)，說明DNA甲基化是HBx導(dǎo)致該基因表達(dá)下調(diào)的原因之一。 4.成功構(gòu)建了系列序貫缺失5’端SP1結(jié)合位點(diǎn)的Caveolin-1基因啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒；HBx可以通過誘導(dǎo)Caveolin-1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，而降低其完整啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性；轉(zhuǎn)錄因子SP1蛋白可能是Caveolin-1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵激活因子之一。HBx對(duì)Caveolin-1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控可能是通過阻礙轉(zhuǎn)錄因子SP1蛋白與

12、DNA特異性結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。 5.HBx可上調(diào)總DNMT的活性；成功構(gòu)建了DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒；HBx可明顯上調(diào)DNMT1和DNMT3a的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，其mRNA表達(dá)水平也隨之升高；HBx對(duì)DNMT3b無顯著影響。推測(cè)DNMT1和DNMT3a在HBx誘導(dǎo)Caveolin-1基因高甲基化的機(jī)制中可能起到主要的催化作用。 綜上所述，本研究主要結(jié)論如下： 1.Caveolin-1基因在

13、HBV相關(guān)性HCC中的表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)，暗示著腫瘤的預(yù)后不良；外源性轉(zhuǎn)染Caveolin-1基因可抑制HCC的侵襲、運(yùn)動(dòng)能力。 2.HBx蛋白可下調(diào)HCC中Caveolin-1的表達(dá)。其分子機(jī)制為：HBx蛋白從啟動(dòng)子層面上調(diào)了DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3a活性，導(dǎo)致Caveolin-1基因啟動(dòng)子區(qū)域部分CpG位點(diǎn)甲基化，使其中的SP1轉(zhuǎn)錄激活元件失去增強(qiáng)調(diào)節(jié)作用，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而使該基因的表達(dá)