低氧誘導(dǎo)因子-1對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 第一部分：(1)觀察氯化鈷(CoCl2)及HIF-1α過表達(dá)對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞及人宮頸癌Hela細(xì)胞存活及凋亡狀況的影響。(2)觀察CoCl2模擬的低氧以及由pcDNA3-HIF-1α真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的HIF-1α過表達(dá)對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞和Hela細(xì)胞中HGF/c-Met系統(tǒng)mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。(3)對(duì)人HGF基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，尋找可能介導(dǎo)HGF低氧表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子作用位點(diǎn)。 第二部分：根據(jù)生物

2、信息學(xué)分析結(jié)果，在Hela和轉(zhuǎn)染效率較高HEK293細(xì)胞中，研究HIF-1α對(duì)TGF-β2基因表達(dá)調(diào)控的作用機(jī)制，并進(jìn)一步觀察重組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(TGF-β2)對(duì)Hela細(xì)胞中HGF表達(dá)的影響， 方法： 第一部分：(1)體外培養(yǎng)乳鼠原代心肌細(xì)胞和Hela細(xì)胞，應(yīng)用MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)CoCl2對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞和Hela細(xì)胞存活、增殖及凋亡的影響。(2)構(gòu)建pcDNA3-HIF-1α真核表達(dá)質(zhì)粒(3)免疫印跡檢測(cè)CoC

3、l2和pcDNA3-HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的HIF-1α過表達(dá)后，Hela細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)。(4)RT-PCR檢測(cè)100μmol/LCoCl2作用6～72h后，心肌細(xì)胞中HGFmRNA的表達(dá)。(5)WesternBlot檢測(cè)100μmol/LCoCl2作用心肌細(xì)胞12h后HIF-1α蛋白的表達(dá)。(6)相對(duì)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CoCl2和pcDNA3-HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，Hela細(xì)胞中HGF/c-Metm

4、RNA的表達(dá)。(7)ELISA檢測(cè)CoCl2對(duì)Hela細(xì)胞中分泌性HGF蛋白表達(dá)的影響。(8)利用生物信息學(xué)分析人HGF基因啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 第二部分：(1)構(gòu)建pGL3-EPO-HRE熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和pGL3-TGF-β2及其五個(gè)突變體的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。(2)WesternBlot和雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)CoCl2和pcDNA3-HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，Hela和HEK293細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)量

5、及其DNA結(jié)合活性。(3)相對(duì)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)250μmol/LCoCl2單獨(dú)作用Hela和HEK293細(xì)胞6h后，TGF-β2mRNA的表達(dá)，以及CoCl2處理和pcDNA3-HIF-1α質(zhì)-3-粒轉(zhuǎn)染后，Hela細(xì)胞中TGF-β2mRNA的表達(dá)。(4)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)CoCl2和pcDNA3-HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)TGF-β2啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因及其相應(yīng)突變載體報(bào)告基因活性的影響。(5)在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行CHIP實(shí)驗(yàn)，

6、證實(shí)HIF-1α在TGF-β2基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。(6)ELISA法檢測(cè)重組TGF-β2作用Hela細(xì)胞后，HGF蛋白的表達(dá)量。 結(jié)論： (1)心肌細(xì)胞和Hela細(xì)胞對(duì)CoCl2毒性的耐受程度不同，心肌細(xì)胞較低而Hela細(xì)胞較高。 (2)HIF-1α過表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞的調(diào)亡作用可能是通過改變凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的比值來實(shí)現(xiàn)的。 (3)在心肌細(xì)胞和Hela細(xì)胞中，CoCl2和pcDNA3-H