肝細(xì)胞生長因子抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：
　　 克隆肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因，構(gòu)建其重組真核表達(dá)載體；觀察HGF拮抗經(jīng)足葉乙甙(VP-16)處理后5株細(xì)胞的凋亡發(fā)生；轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，觀察HGF基因的表達(dá)及對Raji細(xì)胞凋亡的影響；構(gòu)建動物模型，觀察HGF的抗凋亡和促血管新生的生物學(xué)效應(yīng)，為研究HGF的生物學(xué)效應(yīng)做相關(guān)基礎(chǔ)工作。
　　 方法：
　　 1．HGF基因的克隆與重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定
　　 由新鮮人肝組織提取總RNA，行逆

2、轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)獲HGF基因cDNA，與載體pMD19-TSimple連接，構(gòu)建重組克隆載體pMD19-Tsimple-HGF。將重組克隆載體以冷CaCl2法轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α并行氨芐青霉素和α-篩選，采用菌落直接PCR、MluI和SalI雙酶切及序列分析等方法，證實目的片段的存在和序列正確。
　　 2．HGF基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　 將轉(zhuǎn)化重組克隆載體pMD19-TSimple-HGF的E.Coli

3、DH5α增菌后，提取重組載體行MluI和SalI雙酶切，行瓊脂糖凝膠電泳分離后將目的片段進(jìn)行膠回收并測定濃度，與經(jīng)相同雙酶切的載體pVITRO2-mcs提取物連接成重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-HGF。將重組表達(dá)載體以冷CaCI2法轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α并行潮霉素B(100μg/ml)篩選，經(jīng)菌落直接PCR、MluI和SalI雙酶切等方法確定目標(biāo)片段的存在。
　　 3．細(xì)胞培養(yǎng)條件及篩選用潮霉素B濃度的確定
　　

4、 在維持底層膠瓊脂糖濃度為0.5％的基礎(chǔ)上，對上層膠瓊脂糖濃度(0.1％～0.5％)和細(xì)胞濃度(100個/孔～5000個/孔)進(jìn)行選擇，改良瓊脂糖半固體培養(yǎng)體系。取對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，以終濃度為1×105個/ml分別接種于含10～200μg/ml潮霉素B的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5％CO2作靜置培養(yǎng)，以培養(yǎng)14天后仍有Raji細(xì)胞存活的最低潮霉素B濃度作為篩選用濃度。
　　 4．HGF基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染與陽性克隆的鑒

5、定
　　 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法行重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞。37℃、5％CO2常規(guī)靜置培養(yǎng)24h后，采用50μg/ml潮霉素B進(jìn)行篩選。以未處理Raji細(xì)胞和僅加脂質(zhì)體Raji細(xì)胞為空白對照，以載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞為陰性對照。取篩選后存活組細(xì)胞提取總RNA，行RT-PCR，電泳，檢測HGF基因的存在以確定成功轉(zhuǎn)染。
　　 5．IIGF基因轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)水平的檢測
　　 取第1、7、15代

6、HGF基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后采用實時熒光定量PCR，檢測HGFmRNA的表達(dá)水平并評價其表達(dá)穩(wěn)定性，以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組為對照。
　　 6．HGF基因轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)的檢測
　　 取對數(shù)生長期的HGF基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞，采用Westernblot、細(xì)胞免疫化學(xué)法定性檢測HGF蛋白的表達(dá)。此外，分別收集第1、7、15代HGF基因轉(zhuǎn)染后Raji細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，

7、采用ELISA法定量檢測HGF蛋白的表達(dá)，并評價HGF蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組、載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組作為對照。
　　 7．HGF基因轉(zhuǎn)染對Raji細(xì)胞的生物學(xué)性狀的影響
　　 取HGF基因轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞分別作半固體克隆培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)和單層細(xì)胞培養(yǎng)，置37℃、5％CO2作常規(guī)靜置培養(yǎng)。第3天起每天觀察細(xì)胞的生長情況至14天，觀察集落形成情況，分別評價HGF基因轉(zhuǎn)染對Raji細(xì)胞的增殖、侵襲和遷

8、徙的影響。
　　 8．HGF蛋白抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的體外實驗
　　 將處對數(shù)生長期的5種腫瘤細(xì)胞株(HL-60急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系、PC-3前列腺癌細(xì)胞系、HeLa宮頸癌細(xì)胞系、A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系、Raji淋巴瘤細(xì)胞系)分別以1×106/孔接種至6孔板，37℃、5％CO2常規(guī)靜置培養(yǎng)24h后，適宜濃度VP-16處理6h，加入HGF(終濃度為100ng/ml)，37℃、5％CO2常規(guī)靜置培養(yǎng)24h，再按相關(guān)實驗進(jìn)行

9、操作。以未經(jīng)VP-16處理的細(xì)胞和處理的細(xì)胞為對照。
　　 9．CCK-8細(xì)胞毒性試驗
　　 于96孔板每孔內(nèi)加入100μl細(xì)胞，加入VP-16處理，置37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12h，加10μlCCK-8工作液，孵育1～4h，經(jīng)酶標(biāo)儀在450nm測定吸光度。
　　 10．HE染色檢測細(xì)胞形態(tài)變化
　　 以細(xì)胞涂片(Raji、HL-60)或細(xì)胞爬片(PC-3、HeLa、A549)方式制片，用95％

10、乙醇常溫固定2-3min，水洗后，行HE染色，光鏡下檢測并計數(shù)。
　　 11．吖啶橙染色檢測細(xì)胞凋亡
　　 制備活細(xì)胞懸液，濃度約為1×107/ml。取95μl細(xì)胞懸液，加5μl吖啶橙貯存液，混勻。吸一滴于潔凈玻片上，蓋玻片封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并計數(shù)。
　　 12．磷脂酰絲氨酸外翻與核膜完整性分析
　　 采用AnnexinV/PI雙染經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測。收集對數(shù)生長期的5種腫瘤細(xì)胞株(HL-60、P

11、C-3、HeLa、A549、Raji)，制備單個細(xì)胞懸液，離心，PBS洗滌后bindingbuffer重懸，調(diào)整濃度為1×106/ml。取100μl細(xì)胞懸液，加5μlAnnexinV和5μlPI，混勻常溫避光孵育15min，加400μl1×bindingbuffer在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
　　 13．HGF基因轉(zhuǎn)染抗淋巴瘤細(xì)胞的凋亡作用的體外實驗
　　 將處對數(shù)生長期的HGF基因轉(zhuǎn)染的Raji細(xì)胞，以1×106/

12、孔接種至6孔板，37℃、5％CO2常規(guī)靜置培養(yǎng)24h后，用VP-16(終濃度為100ng/ml)于37℃、5％CO2處理6h，采用同上行CCK-8處理，同時檢測其形態(tài)學(xué)特征(HE染色、吖啶橙染色)和生化特征(AnnexinV/PI)的變化。以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞和未處理的轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞為對照。
　　 14．裸鼠體重和腫瘤體積的測量
　　 Raji細(xì)胞接種裸鼠后每7日用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小一次，并稱裸鼠體重，連續(xù)觀測8周。

13、8周后稱裸鼠體重，拉頸處死裸鼠，剝離皮下腫瘤，測量腫瘤長、短徑。腫瘤體積(V)按公式計算：V=3.14/6×a×b2，其中a為腫瘤的長徑，b為短徑。
　　 15．細(xì)胞凋亡指數(shù)的檢測
　　 切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化。20μg/ml蛋白酶K室溫消化，采用原位DNA片段末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡。以細(xì)胞核中有黑色顆粒者為陽性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞，每例切片至少計數(shù)10個400倍視野，以平均每1000個細(xì)胞核中含凋亡細(xì)胞個數(shù)

14、作為凋亡指數(shù)。每次實驗設(shè)陰性對照和陽性對照。
　　 16．腫瘤微血管密度的檢測
　　 采用SP法染色，光鏡下進(jìn)行微血管計數(shù)并取其均值：每張切片先在低倍鏡(100倍)下全面觀察，確定5個血管密度最高區(qū)域，在高倍鏡(200倍)下進(jìn)行微血管計數(shù)，取各區(qū)域均值作為該標(biāo)本的微血管密度。
　　 結(jié)果：
　　 1．HGF基因的克隆及其重組克隆載體的構(gòu)建與鑒定
　　 新鮮人肝組織提取總RNA后行RT-PCR，可見

15、一約2.3kb的特異性條帶，與目的片段大小一致(2229bp)，提示HGFcDNA片段成功擴(kuò)增。將構(gòu)建的重組克隆載體pMD19-TSimple-HGF轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α，篩選出陽性菌落。將陽性菌落直接PCR產(chǎn)物、重組克隆載體SalI和MluI雙酶切產(chǎn)物和重組克隆載體提取物等同時電泳，可見存在與目的片段大小一致的特異性條帶(2229bp)，提示pMD19-TSimple-HGF重組克隆載體成功構(gòu)建。取純化的重組克隆載體pMD19-T

16、Simple-HGF行測序，序列測定結(jié)果與Genebank報道的序列相同，表明重組于載體的HGF基因片段序列正確。
　　 2．HGF基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　 將構(gòu)建的重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-HGF轉(zhuǎn)染E.ColiDH5α后采用潮霉素B篩選出陽性菌落。將HGF基因的RT-PCR產(chǎn)物、陽性菌落直接PCR產(chǎn)物、重組表達(dá)載體SalI和MluI雙酶切產(chǎn)物、重組表達(dá)載體提取物等同時電泳，發(fā)現(xiàn)存在與目的片段大

17、小一致的特異性條帶存在(2229bp)，提示重組表達(dá)載體pVITRO2-mcs-HGF獲成功構(gòu)建。
　　 3．細(xì)胞培養(yǎng)條件及篩選用潮霉素B濃度的確定
　　 采用24孔板進(jìn)行半固體培養(yǎng)時，低層膠瓊脂糖濃度為0.5％、上層膠瓊脂糖濃度為0.3％、每孔細(xì)胞數(shù)為1000個。潮霉素B濃度以50μg/ml作為轉(zhuǎn)染后細(xì)胞篩選用濃度。
　　 結(jié)論:
　　 HGF基因獲成功克隆并構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs