肝細(xì)胞生長因子的克隆、表達(dá)以及體內(nèi)外的應(yīng)用.pdf

1、目的：本研究建立了一種非病毒型人肝細(xì)胞生長因子（Human hepatocyte growth factor,HGF）的基因治療方式，避免病毒載體基因治療所導(dǎo)致的副作用。通過定性及定量檢測體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞中HGF的表達(dá)及其體內(nèi)應(yīng)用，為HGF治療脫發(fā)、促進(jìn)毛發(fā)再生的臨床應(yīng)用提供一個(gè)前景良好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：克隆人的hHGF全長cDNA片段，插入pTARGET真核表達(dá)載體中，得到pTARGET-HGF質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體lip

2、ofectamin2000包裹重組質(zhì)粒將其轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的人的皮膚成纖維細(xì)胞中（Human skin fibroblasts,HSF）。由于本研究室之前已經(jīng)構(gòu)建成功的pEGFP-N1-HGF含有報(bào)告基因綠色熒光蛋白（GFP），在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率具有直觀性，所以在探索最佳細(xì)胞接種密度、DNA濃度和脂質(zhì)體濃度等因素時(shí)，用pEGFP-N1-HGF得到的最佳轉(zhuǎn)染率作為參考。采用蛋白質(zhì)印記方法（western blot）、酶聯(lián)免疫吸附測定法

3、（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分別進(jìn)行HGF蛋白表達(dá)的定性定量檢測后，將其通過皮下注射應(yīng)用于小鼠體內(nèi)，通過HE染色、免疫組化（Immunofluorescence staining）檢測HGF在小鼠皮膚內(nèi)的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.質(zhì)粒構(gòu)建成功后，雙酶切結(jié)果：經(jīng)去內(nèi)毒素提取純化質(zhì)粒后，BamHI、SalI進(jìn)行雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定后，可得到5.67kb和2.2kb兩個(gè)片段，與

4、pTARGET質(zhì)粒的圖譜相符，證明所得到的質(zhì)粒為重組子pTARGET-HGF。2.經(jīng)傳代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞在達(dá)到對(duì)數(shù)期的良好生長狀態(tài)，既80％的細(xì)胞達(dá)到融合后，轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒pTARGET-HGF、pEGFP-N1-HGF，在熒光顯微鏡下觀測到經(jīng)pEGFP-N1-HGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，得到細(xì)胞接種密度為3.0×105，DNA濃度為0.8μg，脂質(zhì)體用量為4.5μL時(shí)獲得最高轉(zhuǎn)染率，分別為57.35±1.29%、52.47±1.

5、26%和57.73±1.31%。3.體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，采用westernblot證明重組的pTARGET-HGF基因在成纖維細(xì)胞中有所表達(dá)，同時(shí)提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清液，經(jīng)ELISA鑒定后檢測到hHGF在轉(zhuǎn)染到人的皮膚成纖維細(xì)胞后可以分泌出hHGF，其分泌量達(dá)到（5.76~10.74ng/9×105cells）。將其用于體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，毛囊生長明顯濃密，且經(jīng)免疫組化檢測到HGF在皮膚中的表達(dá)。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建含有H