肝細(xì)胞生長因子質(zhì)粒的建立及其在成纖維細(xì)胞的表達(dá)與鑒定.pdf

1、目的:構(gòu)建含人的肝細(xì)胞生長因子(Human hepatocyte growth factor)基因真核表達(dá)載體pEGFP-N1-HGF,探討其在體外培養(yǎng)人的成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與表達(dá),為其在體內(nèi)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:RT-PCR擴(kuò)增人的間充質(zhì)干細(xì)胞中hHGF全長cDNA片段,克隆入pEGFP-N1真核表達(dá)載體中,獲得pEGFP-N1-HGF重組質(zhì)粒。應(yīng)用脂質(zhì)體技術(shù)以綠色熒光蛋白(GFP)作為報(bào)告基因,采用脂質(zhì)體Lipo f

2、ectamine2000包裹pEGFP-N1-HGF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人的皮膚成纖維細(xì)胞中,研究了細(xì)胞接種密度、DNA用量、脂質(zhì)體與DNA的比例等因素對(duì)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率的影響,獲得表達(dá)克隆。采用熒光顯微鏡觀察、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Kr-PCR)、蛋白質(zhì)印記方法(Western Blotting)鑒定和ELISA方法定性和定量的測(cè)定hHGF的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果:提取的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定后可得到4660

3、bp和2200bp兩個(gè)片段,與原質(zhì)粒圖譜符合,表明所提取的質(zhì)粒為重組pEGFP-N1-HGF。2.人的皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)2.5次傳代后轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-HGF后,熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)發(fā)出綠色熒光,在細(xì)胞接種密度為2×105、0.8ugDNA用量、2.5:1的脂質(zhì)體與DNA比例時(shí),轉(zhuǎn)染效率最高分別為22.73±0.44％、21.88±0.34％、22.29±0.42％。3.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞提取總RaNA后經(jīng)過RT-PCR能擴(kuò)增HG

4、F cDNA預(yù)期的756 bp片段,證實(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在成纖維細(xì)胞內(nèi)有轉(zhuǎn)錄,Western blotting證實(shí)轉(zhuǎn)染HGF基因在成纖維細(xì)胞內(nèi)有HGF蛋白的表達(dá),同時(shí)通過ELlSA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液,表明轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞中有分泌,其分泌量為(5.9～7.55 ng／8×105 cells)。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-HGF,并證實(shí)其能夠在成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄與表達(dá)分泌,提示我們構(gòu)建的成纖維細(xì)胞模型能夠替代毛乳頭細(xì)胞分