低氧誘導(dǎo)因子-1α介導(dǎo)鼠胚成骨細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察低氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α，）在化學(xué)誘導(dǎo)的低氧狀態(tài)下培養(yǎng)的原代鼠胚成骨細(xì)胞中的表達(dá)變化，并初步探討在低氧條件下HIF-1α，對(duì)成骨細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響。 方法： 1．在無菌條件下取妊娠19天左右的KM胎鼠顱骨，進(jìn)行原代鼠胚成骨細(xì)胞的培養(yǎng)，并用“反復(fù)貼壁法”對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化，之后對(duì)傳代第3代培養(yǎng)的細(xì)胞持續(xù)計(jì)數(shù)8天，最后繪制細(xì)胞生長曲線，同時(shí)對(duì)已培養(yǎng)7天

2、的第4代細(xì)胞應(yīng)用鈣-鈷染色法檢測(cè)細(xì)胞的堿性磷酸酶，進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定。 2．取傳代第3代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，以含125umol/L終濃度氯化鈷的DMEM常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)不同時(shí)間，進(jìn)行化學(xué)模擬缺氧狀態(tài)，對(duì)低氧培養(yǎng)的細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將培養(yǎng)不同時(shí)間的成骨細(xì)胞分別設(shè)為0、1、3、5、7天缺氧組。同時(shí)，對(duì)常氧培養(yǎng)的第3代細(xì)胞設(shè)0、1、3、5、7天常氧組。 3．采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)

3、檢測(cè)低氧和常氧培養(yǎng)不同時(shí)間的成骨細(xì)胞HIF-1α和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）m RNA的表達(dá)變化。 4．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有的實(shí)驗(yàn)都重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，使用SPSS 12．0軟件包進(jìn)行單因素方差分析，以P<0．05判斷為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： 1．經(jīng)組織塊法培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，多呈梭形、三角形，有較多突起，部分細(xì)長突起?？缭郊?xì)胞與遠(yuǎn)處的細(xì)胞突起相連接；胞核呈圓形或橢圓形，居中或偏于一側(cè)，輪廓清晰，可見1～3

4、個(gè)核仁。從接種后的第1天開始，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增較慢，為細(xì)胞生長適應(yīng)期，以后細(xì)胞增長加速，第6天達(dá)到高峰，以后增長速度逐漸減慢，細(xì)胞數(shù)量開始下降。第4代培養(yǎng)的細(xì)胞堿性磷酸酶鈣-鈷染色結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有黑色顆粒狀物質(zhì)，有少量分散在細(xì)胞周圍。計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，成骨細(xì)胞陽性率為95．5%，陽性細(xì)胞多為梭形和鱗片形細(xì)胞，符合成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性。 2．經(jīng)氯化鈷處理后3天，細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上可見細(xì)胞膜邊界不清，細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)致密

5、，核染色質(zhì)邊集；氯化鈷處理后7天部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。對(duì)氯化鈷處理后的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，可見細(xì)胞數(shù)量于第5天達(dá)到高峰，但遠(yuǎn)低于同一時(shí)間的常氧組，之后細(xì)胞數(shù)量迅速降低。 3．反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)各基因的表達(dá)變化：通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并經(jīng)Lab-work軟件分析可見，經(jīng)氯化鉆處理后，HIF-1α和VEGF mRNA的表達(dá)隨時(shí)間的延長逐漸增加（P<0．01），除第0天外，均高于常氧組（P<0．01），而常氧組各時(shí)間段則無明顯

6、變化（P>0．05）： 結(jié)論： 1：通過氯化鈷化學(xué)模擬低氧狀態(tài)，可以促使成骨細(xì)胞表達(dá)大量的HIF-1α。 2在低氧條件下，HIF-1α能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增強(qiáng)表達(dá)VEGF，從而可能加強(qiáng)局部血管形成，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，加速骨形成，促進(jìn)骨創(chuàng)傷的修復(fù)。可能也為骨缺血，骨壞死，骨折等疾病的臨床VEGF基因治療提供初步理論探討。 3．改良的組織塊培養(yǎng)法結(jié)合了傳統(tǒng)的組織塊法和酶消化法的優(yōu)點(diǎn)，可在較短時(shí)間內(nèi)獲得較多的成骨