Caveolin-1調(diào)節(jié)癌細(xì)胞線粒體功能并介導(dǎo)能量代謝轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制研究.pdf

1、癌癥獨(dú)特的能量代謝方式是其惡性表型的標(biāo)志性特征之一，發(fā)展針對(duì)癌癥能量代謝的治療手段將是實(shí)現(xiàn)癌癥有效治療的新方向。有多篇報(bào)道指出細(xì)胞小窩結(jié)構(gòu)的成分蛋白：小窩蛋白1（caveolin-1, Cav-1）與細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)，同時(shí)小窩結(jié)構(gòu)也是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行信息交換的橋梁，其運(yùn)動(dòng)性是其功能發(fā)揮的基礎(chǔ)。本文通過(guò)研究Cav-1/小窩結(jié)構(gòu)內(nèi)吞及運(yùn)動(dòng)性信號(hào)途徑，以及Cav-1和線粒體之間的相互作用，揭示Cav-1在細(xì)胞能量代謝中所扮演的角色，以及

2、Cav-1運(yùn)動(dòng)性的關(guān)鍵作用，取得的主要研究成果如下：
　　1. RalA調(diào)節(jié)Cav-1/小窩依賴的內(nèi)吞過(guò)程：（a）通過(guò)考察牛血清白蛋白（BSA，bovine serum albumin）誘導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程中RalA活化狀態(tài)的變化，證明內(nèi)吞過(guò)程可觸發(fā)RalA活化。（b）通過(guò)檢測(cè)RalA持續(xù)活化突變體和顯性負(fù)突變體對(duì)內(nèi)吞以及RalA，Cav-1結(jié)合水平的影響，說(shuō)明內(nèi)吞過(guò)程的實(shí)現(xiàn)以及RalA與Cav-1的結(jié)合都需要RalA活化。（c）利用s

3、iRNA的方法抑制RalA的表達(dá)，同時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)?；謴?fù)其表達(dá)，對(duì)比抑制前后以及恢復(fù)表達(dá)后內(nèi)吞水平的變化，證明RalA是Cav-1/小窩內(nèi)吞的重要調(diào)節(jié)分子。
　　2. RalA通過(guò)活化下游效應(yīng)分子PLD（Phospholipase D）調(diào)節(jié)Cav-1/小窩依賴的內(nèi)吞：（a）通過(guò)研究PLD非特異性抑制劑對(duì)內(nèi)吞的影響，證實(shí)PLD活化對(duì)內(nèi)吞的促進(jìn)作用。（b）采用PLD1和PLD2特異性抑制劑確定只有PLD2是內(nèi)吞的調(diào)節(jié)分子。（c）PLD2抑制

4、劑和突變體對(duì)Cav-1-RFP運(yùn)動(dòng)性的抑制再次證實(shí)PLD2在此過(guò)程中的重要作用。（d）通過(guò)PA感應(yīng)器GFP-PASS（phosphatidic acid biosensor with superior sensitivity）觀察內(nèi)吞過(guò)程中PLD2下游產(chǎn)物PA（phosphatidic acid）在小窩生成并由此促進(jìn)Cav-1/小窩依賴的內(nèi)吞。
　　3. Cav-1抑制引起線粒體形態(tài)學(xué)的改變：（a）采用siRNA的手段抑制Cav-

5、1的表達(dá)，同時(shí)觀察線粒體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)線粒體呈現(xiàn)片段化和增長(zhǎng)的雙重改變。（b）利用PA-GFP（photoactive-GFP）在線粒體的擴(kuò)散程度量化線粒體的基質(zhì)融合程度，此結(jié)果亦可代表線粒體的動(dòng)態(tài)水平。對(duì)比Cav-1抑制前后，發(fā)現(xiàn)抑制后細(xì)胞的線粒體有更高的動(dòng)態(tài)水平。（c）通過(guò)FRAP（fluorescence recovery after photobleaching）方法測(cè)試基質(zhì)蛋白的運(yùn)動(dòng)速率，進(jìn)一步強(qiáng)化Cav-1抑制提升線粒體動(dòng)態(tài)水平

6、的結(jié)論。
　　4. Cav-1通過(guò)抑制Mfn2和Drp1的線粒體定位改變線粒體動(dòng)態(tài)：（a）線粒體組分分離發(fā)現(xiàn)抑制Cav-1，Mfn2和Drp1在線粒體的表達(dá)量增加。（b）通過(guò)免疫共沉淀和FRET（fluorescence resonance energy transfer）的方法證實(shí)Cav-1分別與Mfn2和Drp1二者結(jié)合。（c）免疫熒光染色同樣檢測(cè)到抑制Cav-1時(shí)Drp1在線粒體的定位增加。（d）引入ER和線粒體的人工鏈接分

7、子OMM-ER-mRFP加強(qiáng)ER和線粒體交互，發(fā)現(xiàn)Mfn2在Cav-1抑制的情況下發(fā)生ER回流，說(shuō)明Cav-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)ER和線粒體交互來(lái)調(diào)整Mfn2在二者的表達(dá)水平。
　　5. Cav-1的抑制是線粒體自噬的誘因：（a）對(duì)比Cav-1抑制前后線粒體比量的變化發(fā)現(xiàn)Cav-1抑制導(dǎo)致線粒體比量減少。（b）通過(guò)對(duì)比細(xì)胞自噬標(biāo)志分子表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)Cav-1抑制細(xì)胞的自噬水平升高。（c）引入mt-Keima檢測(cè)線粒體自噬，證實(shí)Cav-1的

8、低表達(dá)可誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生。
　　6. RalA通過(guò)Cav-1影響線粒體功能和細(xì)胞能量代謝：（a）采用siRNA的手段實(shí)現(xiàn)RalA和Cav-1的單獨(dú)和共同抑制。（b）檢測(cè)MMP，ATP，H2O2和糖酵解產(chǎn)物L(fēng)-lactate的生成，發(fā)現(xiàn)RalA和Cav-1抑制的細(xì)胞中出現(xiàn)MMP和ATP生成的降低以及H2O2和L-lactate的增加，并且RalA和Cav-1共同抑制時(shí)與單獨(dú)抑制Cav-1結(jié)果無(wú)異，證明RalA的作用是借Cav-1