衰老過程中線粒體順烏頭酸酶活性調(diào)節(jié)及相關(guān)線粒體能量代謝研究.pdf

1、目的：
　　利用不同月齡的大鼠，研究在衰老過程中線粒體順烏頭酸酶(mitochondrialaconitase，m-aconitase，AC02)對(duì)線粒體能量代謝的影響及其機(jī)制。
　　對(duì)象與方法：
　　1.選用不同月齡(1月，8月，16月，24月)的SD雄性大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以大鼠腦組織AC02為研究對(duì)象。
　　2.蔗糖密度梯度離心法分離高純度大鼠腦組織線粒體。ACO2活性的檢測(cè)是通過340nm處吸光度測(cè)定在檸檬酸

2、轉(zhuǎn)變成α-酮戊二酸的反應(yīng)過程中NADPH生成的量，從而間接表示順烏頭酸酶活性的大小。檢測(cè)不同月齡大鼠腦組織ACO2活性，并用Western Blot和Real Time PCR檢該酶表達(dá)水平。
　　3.利用H2O2的強(qiáng)氧化能力，在體外模擬體內(nèi)的氧化損傷。用H2O2處理所提取的線粒體，分別比較不同濃度(0μM，50μM，50μM，100μM，200μM，400μM)的H2O2及不同處理時(shí)間(0min，30min，1h，2h)的順烏頭

3、酸酶活性變化。
　　4.測(cè)定不同月齡大鼠腦組織非血紅素鐵含量。在酸性條件下，鐵從轉(zhuǎn)鐵蛋白上游離出來，并沉淀蛋白。上清中的三價(jià)鐵被還原為二價(jià)鐵，亞鐵離子與菲咯嗪反應(yīng)形成紫色復(fù)合物。在562 nm處測(cè)其吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鐵含量。
　　5.利用透射電鏡觀察線粒體在衰老中的形態(tài)變化。通過檢測(cè)線粒體膜電位和能量合成研究線粒體在衰老過程中的功能變化。用熒光探針JC-1標(biāo)記線粒體，分光光度計(jì)檢測(cè)線粒體膜電位的變化情況。用高效液相色譜

4、法檢測(cè)腦組織ATP、ADP、AMP含量并計(jì)算能荷。
　　結(jié)果：
　　1.Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，用蔗糖線性梯度離心法能得到較高純度的線粒體。ACO2活性隨著月齡增加逐漸下降，然而其蛋白表達(dá)水平和RNA表達(dá)水平在不同月齡間沒有明顯差異。
　　2.在體外氧化壓力作用下，ACO2活性與H2O2的處理濃度和時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。
　　3.腦組織非血紅素鐵的含量在衰老過程中逐漸積累。
　　4.衰老大鼠線粒體形態(tài)

5、發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度損傷。在衰老過程中，線粒體膜電位降低，ATP合成量與能荷呈明顯下降趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　1.ACO2活性中心的[4Fe-4S]2+，易受ROS攻擊而失活。本研究中，H2O2處理后所致的ACO2酶活下降證明了該結(jié)論。對(duì)不同月齡大鼠ACO2檢測(cè)結(jié)果證明衰老過程中，機(jī)體ROS日益增多，ACO2遭受氧化壓力加重，導(dǎo)致酶活性增齡性遞減。此外，衰老過程中ACO2活性的降低并非其蛋白和基因表達(dá)降低，可能是其蛋白

6、結(jié)構(gòu)域受影響而造成該酶的功能缺失。
　　2.衰老過程中伴隨著鐵的積累。衰老過程中產(chǎn)生的過氧化物使鐵蛋白上的鐵游離出來，使得組織鐵含量升高。此外，釋放的Fe經(jīng)過Fenton反應(yīng)促使更多的ROS產(chǎn)生，加重氧化損傷。
　　3.衰老大鼠線粒體形態(tài)不如年輕組規(guī)則，出現(xiàn)明顯的腫脹和空泡，雙膜解體，嵴不清楚，甚至消失，說明衰老組線粒體結(jié)構(gòu)可能有不同程度損傷。線粒體膜電位和腦組織能荷都隨著衰老進(jìn)程逐漸降低。ACO2活性降低可能影響TCA循環(huán)