參麥方改善缺血心肌線粒體功能和能量代謝作用機(jī)制研究.pdf

1、參麥方是在生脈散基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的方劑，由紅參和麥冬兩味藥組成，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津等功效。藥理研究表明，其具有強(qiáng)心、抗心律失常、抗休克、抗炎和調(diào)節(jié)血壓的作用。但參麥方作用于機(jī)體的靶點(diǎn)尚不明確，為了闡釋參麥方作用的機(jī)理，本論文以參麥方為研究對(duì)象，采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)究了參麥方對(duì)心肌缺血大鼠心肌蛋白質(zhì)組的影響，在離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞上對(duì)線粒體功能及能量代謝相關(guān)蛋白/基因表達(dá)進(jìn)行了研究，初步探索了該方改善缺氧心肌細(xì)胞線

2、粒體功能和能量代謝的作用機(jī)制，主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.參麥方的蛋白質(zhì)組研究
　　在大鼠心肌缺血模型上分別給予參麥方及紅參、麥冬提取物7天后，提取缺血心肌蛋白，采用iTRAQ技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究，鑒定心肌缺血后及紅參、麥冬、參麥方給藥后心肌缺血區(qū)的差異表達(dá)蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了100余個(gè)差異蛋白，并采用Western blot法對(duì)四個(gè)差異蛋白的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。研究結(jié)果表明，大鼠心肌缺血后，有60多個(gè)蛋白發(fā)生顯著性變化;參麥方、紅

3、參提取物和麥冬提取物各自調(diào)節(jié)了一些蛋白的表達(dá)情況。約半數(shù)的差異蛋白位于線粒體膜和基質(zhì)，其功能與氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)、ATP酶活性等相關(guān)。缺血心肌中這類蛋白表達(dá)下調(diào)，而紅參、麥冬提取物及參麥方能不同程度地恢復(fù)其蛋白表達(dá)，提示維持線粒體功能和恢復(fù)能量代謝是參麥方抗心肌缺血的主要作用機(jī)制。選取了ATP5D、NDUFB10、MDH1和TNNC1等四個(gè)變化顯著的蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，Western blot驗(yàn)證結(jié)果與 iTRAQ技術(shù)蛋白質(zhì)組研究分析

4、結(jié)果一致。
　　2.參麥方改善缺氧心肌細(xì)胞線粒體功能的作用機(jī)制研究
　　采用激光共聚焦顯微鏡觀察參麥方及其組分對(duì)缺氧心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響，并測(cè)定細(xì)胞內(nèi)能量物質(zhì)ATP含量以及參麥方及其組分對(duì)常氧/缺氧條件心肌細(xì)胞生物能方面的影響。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧損傷原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞后JC-1標(biāo)記的線粒體膜電位下降，參麥方、紅參和麥冬提取物保護(hù)的缺氧心肌細(xì)胞其線粒體膜電位得到了一定程度的恢復(fù)，提示參麥方、紅參和麥冬提取物都可減輕缺氧所致的心

5、肌細(xì)胞線粒體膜電位下降。參麥方還能顯著提高胞內(nèi)能量物質(zhì)ATP的含量，且全方藥效優(yōu)于紅參或麥冬提取物單用。此外，通過測(cè)定常氧和缺氧情況下氧氣消耗速率(Oxygen Consumption Rate，OCR)，研究發(fā)現(xiàn)參麥方可顯著提高缺氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)ATP合成量、最大呼吸速率及氧儲(chǔ)備能力，而對(duì)常氧下培養(yǎng)的心肌細(xì)胞氧氣消耗速率無(wú)顯著影響。以上結(jié)果提示，參麥方及其組分對(duì)維持缺氧心肌中線粒體膜電位、ATP水平及恢復(fù)細(xì)胞正常呼吸速率都有明顯的作

6、用，說明參麥方在缺氧條件下保護(hù)了線粒體使其功能得到了一定程度的修復(fù)。
　　3.參麥方改善缺氧心肌細(xì)胞能量代謝的作用機(jī)制研究
　　缺氧及參麥方干預(yù)原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞后，采用CellTiter-Glo化學(xué)發(fā)光法對(duì)其活力進(jìn)行了測(cè)定，Western blot法和RT-PCR法分別檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)能量代謝相關(guān)蛋白與mRNA的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)，參麥方可提高缺氧后原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞活力，降低心肌細(xì)胞的損傷程度，方中紅參組分是保持細(xì)胞活力的主要藥