線粒體在壓力誘導(dǎo)椎間盤細胞凋亡和能量代謝障礙中的作用及其實驗研究.pdf

1、第一部分 兔椎間盤細胞氣壓加壓培養(yǎng)模型的建立
　　 目的:建立兔椎間盤細胞體外氣壓加壓培養(yǎng)模型，觀察在持續(xù)靜壓力培養(yǎng)12h、24h和36h后兔椎間盤細胞生物學(xué)行為改變，評價該細胞加壓模型的優(yōu)缺點。
　　 方法:將體外培養(yǎng)的兔纖維環(huán)和髓核細胞隨機分為對照組（不加壓）、加壓12h組、24h組和36h組，在1MPa 壓力下干預(yù)后觀察各組細胞形態(tài)學(xué)變化、增殖活性和細胞基質(zhì)（COA Ⅰ、Ⅱ及AGG）表達改變。
　　 結(jié)果:

2、加壓培養(yǎng)后，倒置相差顯微鏡下纖維環(huán)和髓核細胞均有不同程度密度減低和細胞體積減小，細胞呈長梭形變。加壓24h和36h 可見明顯纖維環(huán)和髓核細胞增殖活性抑制；髓核細胞加壓時間>12h后即出現(xiàn)AGG的mRNA表達下降，而加壓時間>24h后出現(xiàn)COAⅡ的mRNA表達下降；纖維環(huán)細胞加壓時間>24h后COAⅠ、Ⅱ的mRNA 均出現(xiàn)不同程度的表達下降。
　　 結(jié)論:該細胞氣壓加壓培養(yǎng)裝置可短期內(nèi)模擬機械應(yīng)力導(dǎo)致的兔椎間盤細胞退變改變，為實驗

3、室實施體外壓力細胞實驗提供了一種簡單、安全的方案。
　　 第二部分線粒體凋亡途徑參與過度壓力誘導(dǎo)的兔椎間盤細胞的凋亡
　　 目的:探討過度機械壓力刺激誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的兔纖維環(huán)和髓核細胞凋亡的主要信號途徑。
　　 方法:將體外培養(yǎng)的兔椎間盤纖維環(huán)和髓核細胞給予1MPa的持續(xù)機械壓力干預(yù)12h、24h和36h，另設(shè)不加壓的對照組，各4組。各組纖維環(huán)和髓核細胞達到加壓時間后，流式細胞儀檢測細胞凋亡，熒光顯微鏡、熒光分光光

4、度計和激光共聚焦顯微鏡檢測細胞線粒體膜電位平均相對熒光強度，酶標儀檢測caspase-8，9，3 活性。
　　 結(jié)果:流式細胞儀結(jié)果顯示纖維環(huán)細胞加壓24h組、36h組和髓核細胞加壓12h組、24h組和36h組均出現(xiàn)明顯細胞凋亡增加；熒光顯微鏡、熒光分光光度計和激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，加壓24h組和36h組的纖維環(huán)和髓核細胞以綠色熒光為主，紅色熒光明顯減少，細胞線粒體膜電位均明顯下降；酶標儀結(jié)果顯示髓核細胞組加壓后caspas

5、e-8，9，3 活性均升高，而纖維環(huán)細胞組加壓后caspase-9 活性明顯增強，caspase-8 活性無明顯變。
　　 結(jié)論:1MPa 靜壓力加壓時間>24h 作為過度機械壓力可以明顯誘導(dǎo)椎間盤纖維環(huán)和髓核細胞的凋亡。機械壓力誘導(dǎo)的纖維環(huán)細胞凋亡信號途徑主要是由線粒體依賴的凋亡途徑參與的，而線粒體依賴途徑和DISC 途徑（非線粒體依賴途徑）二者則均參與了髓核細胞的凋亡。
　　 第三部分過度壓力對兔內(nèi)外層纖維環(huán)細胞線粒

6、體功能和超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 目的:研究過度機械壓力對體外藻酸鹽串珠培養(yǎng)的兔椎間盤內(nèi)外層纖維環(huán)細胞線粒體功能和超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　 方法將體外藻酸鹽串珠培養(yǎng)的兔纖維環(huán)細胞分為四組：OA1組為外層纖維環(huán)細胞，不加壓；OA2組為外層纖維環(huán)細胞，1MPa 壓力干預(yù)24h；IA1組為內(nèi)層纖維環(huán)細胞，不加壓；IA2組，內(nèi)層纖維環(huán)細胞，1MPa 壓力干預(yù)24h。加壓完成后，熒光酶標儀檢測ATP 產(chǎn)量，熒光顯微鏡和熒光分光光度計檢測

7、線粒體膜電位和活性氧簇的釋放，分光光度計檢測4 種線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性和透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:兔纖維環(huán)細胞經(jīng)1MPa 壓力作用24h后，與各對照組相比，內(nèi)外層纖維環(huán)細胞均可見ATP 產(chǎn)量明顯減少，活性氧簇釋放增加，線粒體膜電位顯著下降，細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)損傷的病理改變；外層纖維環(huán)細胞呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ活性相比對照組顯著下降，而內(nèi)層纖維環(huán)細胞呼吸鏈酶復(fù)合物僅Ⅲ和Ⅳ活性相比對照組明顯下降。外層纖維環(huán)