非諾貝特對小鼠心肌能量代謝相關基因作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 過氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome Proliferator-activated Receptorα,PPARα)是一類由配體激活的核轉錄因子,屬于細胞核受體超家族,其功能是作為轉錄因子調節(jié)許多基因的表達。PPAR家族在細胞分化、發(fā)育和代謝方面具有重要作用并且在脂肪酸的攝取和氧化中起到轉錄調控作用。PPARγ轉錄輔助因子1(PGC-1)家族基因PGC-1α和PGC-1β與線粒體生物合成和體內能量

2、代謝密切相關。PPARα激動劑非諾貝特(Fenofibrate)是臨床治療用于降血脂的藥物,可以治療高血脂或Ⅱ型糖尿病所引起的脂質代謝紊亂。其作用機理是通過抑制極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白的生產(chǎn)同時加速其分解代謝,從而降低極低密度脂蛋白、膽固醇和甘油三酯含量,為了進一步了解其在代謝方面的作用,我們研究了PPARα激動劑非諾貝特對小鼠心室細胞線粒體功能相關基因表達的影響。首先非諾貝特處理小鼠,然后提取心室RNA并檢測核呼吸因子,線粒體外膜

3、蛋白40,硫辛酸合成酶,細胞色素b,中鏈脂酰輔酶A脫氫酶和過氧化物酶體增殖物激活受體共活化物的mRNA表達水平,同時分析非諾貝特對小鼠心室脂肪含量的影響,上述研究探討了非諾貝特對小鼠心臟能量代謝的作用。
　　 貝特類藥物還可增強機體對于胰島素的敏感性,在緩解糖尿病以及由此引發(fā)的心血管疾病方面有重要作用。本課題組在研究非諾貝特受體PPARα對葡萄糖代謝的調節(jié)機制中發(fā)現(xiàn):在胰島素刺激下,PPARα及其相互作用蛋白一轉錄因子GATA6

4、都促進葡萄糖消耗和提高檸檬酸合酶活性,但同時100nM的胰島素又促進細胞凋亡。為了進一步探討非諾貝特-PPARa-GATA6-胰島素-能量代謝-細胞增殖與凋亡之間的聯(lián)系,我們以能誘導分化為心肌細胞的小鼠畸胎瘤細胞P19CL6為靶細胞,構建穩(wěn)定表達PPARα和GATA6的細胞系,研究不同濃度胰島素對P19CL6細胞及PPARα和GATA6穩(wěn)轉細胞系增殖和凋亡的影響,探討不同濃度胰島素對P19CL6細胞影響的作用機制并研究其與細胞代謝之間的

5、關系。
　　 目的：
　　 本實驗旨在研究PPARα激動劑非諾貝特對小鼠心室細胞線粒體功能有關的基因表達的影響。檢測非諾貝特處理后,核呼吸因子,線粒體外膜蛋白40,硫辛酸合成酶,細胞色素b,中鏈脂酰輔酶A脫氫酶和過氧化物酶體增殖物激活受體共活化物的mRNA表達水平。并觀察非諾貝特對小鼠心室脂肪含量的影響,探討非諾貝特與小鼠心臟能量代謝的關系。此外,我們還探討了另一種與非諾貝特作用機制密切相關的藥物胰島素對P19CL6細胞

6、的作用,旨在研究胰島素對P19CL6細胞的作用機制及與細胞代謝之間的關系。
　　 方法：
　　 1.8周齡昆明種小鼠,隨機分為3組:組1,對照組;組2,非諾貝特處理7天組;組3,非諾貝特處理14天組。每組包含6-8只小鼠。非諾貝特組給予非諾貝特(100mg/kg/day)灌胃7天或14天。對照組給予羧甲基纖維素鈉混懸液灌胃14天。7天或14天以后,處死小鼠,提取心室組織RNA,經(jīng)過反轉錄后,Q-PCR方法檢測小鼠心室中N

7、RF-1,Tom40,Lias,cytochromc b,MCAD和PGC-1α這些基因的mRNA表達情況。另一批同樣處理的小鼠,采用改良的Bligh&Dyer方法提取心室中脂肪,并用甘油三酯定量試劑盒測定其含量。
　　 2.將重組質粒轉染入細胞并經(jīng)過G418篩選后,得到穩(wěn)定表達PPARα和Gata6的細胞系。
　　 3.胰島素對P19CL6正常細胞及穩(wěn)轉細胞的增殖和凋亡研究:正常細胞及穩(wěn)轉細胞經(jīng)過不同濃度的胰島素處理。

8、胰島素的濃度分別為:0、10、50、100nmol/L。處理時間為24h,采用噻唑藍(MTT)比色法檢測不同濃度胰島素對細胞增殖的影響。DAPI染色檢測不同濃度胰島素處理后細胞形態(tài)學改變。流式紐胞術PI單染檢測胰島素處理后對細胞周期的影響。
　　 結果：
　　 1.非諾貝特處理7天后,小鼠心室中NRF-1-L和NRF-1-S mRNA水平與對照組相比都有所下降,其中NRF-1-L mRNA下降22％,與對照組相比具有統(tǒng)計

9、學意義(p＜0.05)。非諾貝特處理14天后,NRF-1-L mRNA水平下降16%,同時,NRF-1-S mRNA水平上升15%。
　　 2.非諾貝特處理7天或者14天后,小鼠心室中Lias mRNA水平與對照組相比無明顯差異。非諾貝特處理7天后,Tom40 mRNA水平與對照組相比無明顯差異;非諾貝特處理14天后,Tom40 mRNA水平與對照組相比增加15%。
　　 3.非諾貝特處理7天或者14天后,小鼠心室中cy

10、tochromc b和MCAD mRNA水平都有所增加。非諾貝特處理14天后,cytochrome b和MCAD mRNA水平分別增加31%和32%,與對照組相比具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 4.非諾貝特處理7天后,PGC-1α mRNA水平與對照組相比無明顯差異。非諾貝特處理14天后,PGC-1α mRNA水平下降31%,與對照組相比具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 5.非諾貝特處理7天后,小鼠心室中脂

11、肪含量無明顯改變,非諾貝特處理14天后,其脂肪含量與對照組相比顯著增加。
　　 6.MTT結果顯示:低濃度胰島素對P19CL6細胞增殖有顯著促進作用(P＜0.05),中濃度胰島素對P19CL6細胞增殖無顯著作用,高濃度胰島素對P19CL6細胞增殖有顯著抑制作用(P＜0.01)。同樣,低濃度胰島素對PPARα和GATA6穩(wěn)轉P19CL6細胞增殖有顯著促進作用(P＜0.05),中濃度胰島素對PPARα和GATA6穩(wěn)轉P19CL6細胞

12、增殖無顯著作用,高濃度胰島素對PPARα和GATA6穩(wěn)轉P19CL6細胞增殖有顯著抑制作用(P＜0.01)。
　　 7.DAPI染色結果顯示:control組的P19CL6細胞,細胞核呈現(xiàn)出均勻彌散熒光,細胞核周邊光滑,完整;10nM組與對照組相比,細胞核形態(tài)無明顯改變;50nM組與對照組相比,細胞數(shù)量減少,但細胞核形態(tài)無明顯改變;100nM組與對照組相比,細胞數(shù)量明顯減少,且出現(xiàn)凋亡核,表現(xiàn)為核固縮,核碎裂和凋亡小體。PPAR

13、α和GATA6穩(wěn)轉P19CL6細胞形態(tài)也是如此。
　　 8.流式細胞術檢測結果顯示:低濃度胰島素處理下的P19CL6細胞,G1期細胞數(shù)量顯著低于對照組(P＜0.05),S期細胞數(shù)量顯著高于對照組(P＜0.05)。GATA6和PPARα穩(wěn)轉P19CL6細胞用低濃度胰島素處理后,S期細胞數(shù)量與對照組相比顯著升高(P＜0.05)。中濃度和高濃度胰島素處理下的P19CL6細胞及PPARα和GATA6穩(wěn)轉P19CL6細胞,S期細胞數(shù)量與對