芪參益氣方促血管新生機(jī)制及抗心肌缺血作用研究.pdf

1、隨著我國人口老齡化進(jìn)程的加劇,缺血性心臟病的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢。藥物治療是缺血性心臟病臨床治療的重要途徑之一,特別是對于無法進(jìn)行手術(shù)治療的冠狀動脈彌漫性狹窄病變患者尤為重要。在我國,大量中藥方劑和中成藥制劑已被用于缺血性心臟病的預(yù)防與治療,但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。治療性血管新生(Therapeutic Aginogenesis)是近年來提出的缺血性心臟病治療新途徑,其原理是通過促進(jìn)心肌缺血區(qū)域新血管的

2、生成和開放新的側(cè)支循環(huán)通路,達(dá)到恢復(fù)缺血心肌的血流供應(yīng)、改善患者癥狀和預(yù)后的目的。因此,研究中藥方劑促血管新生作用并探討其作用機(jī)制對于缺血性心臟病的治療具有重要意義。芪參益氣方治療缺血性心臟病臨床療效顯著,但抗心肌缺血作用機(jī)制還不明確。本論文綜合運(yùn)用多種實(shí)驗技術(shù)手段研究了該方抗急性心肌缺血作用,并探討其促血管新生的作用及機(jī)制;通過體外實(shí)驗進(jìn)一步研究了該方中黃芪的主要活性成分——黃芪甲苷對低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)的影響及其促

3、血管新生機(jī)制;采用代謝組學(xué)技術(shù)研究了該方各組分及其配伍對急性心肌缺血大鼠血漿代謝組的影響。
　　主要研究內(nèi)容如下:1.研究芪參益氣方的抗心肌缺血作用并探討了其促血管新生的作用機(jī)制。運(yùn)用2,3,5,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法、免疫組化(Immunohistochemistry)、熒光定量PCR(Real-time PCR)及蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)觀察了芪參益氣方對急性心肌缺血大鼠血管新生的影響。研究發(fā)

4、現(xiàn):(1)芪參益氣方顯著減小急性心肌缺血大鼠的心肌梗死范圍;(2)芪參益氣方能夠顯著增加心肌缺血大鼠缺血交界區(qū)的血管數(shù)目;(3)芪參益氣方能夠顯著升高缺血心肌中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的mRNA和蛋白表達(dá)水平;(4)芪參益氣方能夠顯著升高缺血心肌中堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的mRNA和蛋白表達(dá)水平;(5)芪參益氣方能夠顯著升高缺血心肌中血小板衍化生長因子B(PDGF-B)的mRNA水平,但對其蛋白表達(dá)無明顯影響。以上結(jié)果提示

5、,芪參益氣方可能通過升高VEGF. bFGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平以及PDGF-B的mRNA水平,促進(jìn)缺血心肌血管新生,從而發(fā)揮抗心肌缺血作用。2.研究該方中君藥黃芪的主要活性成分——黃芪甲苷對HIF-1α的影響及其促血管新生機(jī)制。分別采用Real-time PCR、Western blotting、免疫熒光、Transwell小室、Matrigel膠及雞胚尿囊膜實(shí)驗等方法研究黃芪甲苷對缺氧損傷內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)及其促血管新生

6、機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn):(1)黃芪甲苷顯著提高缺氧損傷后內(nèi)皮細(xì)胞的存活率;(2)黃芪甲苷能夠顯著升高缺氧損傷后內(nèi)皮細(xì)胞的HIF-1α的蛋白表達(dá)水平;(3)黃芪甲苷對HIF-1α的mRNA水平及HIF-1α的蛋白降解幾乎無影響;(4)黃芪甲苷能夠顯著升高內(nèi)皮細(xì)胞中AKT(Ser473)蛋白的磷酸化水平;(5)黃芪甲苷能夠促使HIF-1α向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移并促進(jìn)VEGF轉(zhuǎn)錄,且P13K抑制劑LY294002能夠干預(yù)其效果;6)黃芪甲苷能夠顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)

7、胞遷移、管腔形成及血管新生,且LY294002能夠干預(yù)其效果。以上結(jié)果提示,黃芪甲苷可能通過激活P13K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)HIF-1α的蛋白合成并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,促使VEGF轉(zhuǎn)錄增加而發(fā)揮促血管新生的作用。3.采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析芪參益氣方各組分及其配伍對急性心肌缺血大鼠血漿代謝組的影響。研究發(fā)現(xiàn):與假手術(shù)組大鼠相比,急性心肌缺血大鼠血漿中29個內(nèi)源性代謝物的含量發(fā)生改變,其中7個與能量代謝相關(guān)和7個與氨

8、基酸代謝相關(guān)的內(nèi)源性代謝物含量均明顯增加。對心肌缺血大鼠進(jìn)行給藥后,芪參益氣方各組分及其配伍對這14個內(nèi)源性代謝物含量均有回調(diào)作用。提示芪參益氣方可能通過調(diào)節(jié)能量代謝和氨基酸代謝發(fā)揮抗急性心肌缺血的作用。
　　本論文研究結(jié)果表明,芪參益氣方抗心肌缺血的作用機(jī)制包括:調(diào)節(jié)促血管生長因子如VEGF、bFGF、PDGF-B的mRNA和蛋白表達(dá)水平,以及調(diào)節(jié)能量代謝和氨基酸代謝。其君藥的主要活性成分——黃芪甲苷主要通過激活PI3K/AKT