切應(yīng)力在Caveolin-1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞粘附與遷移的力學(xué)生物學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、目前，超過(guò)90％的癌癥患者死亡原因是由于腫瘤的轉(zhuǎn)移，腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移過(guò)程中，癌細(xì)胞會(huì)受到不同的機(jī)械力作用，如與其它細(xì)胞發(fā)生碰撞、血流產(chǎn)生的切應(yīng)力。研究表明，切應(yīng)力在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)以及黏附過(guò)程中有著重要作用。Cav-1作為小窩結(jié)構(gòu)上重要的組成成分參與調(diào)控多種細(xì)胞功能，其中包括腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移等。但是，在切應(yīng)力條件下，Cav-1如何調(diào)控乳腺癌細(xì)胞粘附、骨架重構(gòu)、運(yùn)動(dòng)及其相關(guān)信號(hào)通路仍然不清楚。因此本研究主要探討Cav-1是如何介導(dǎo)切應(yīng)力

2、引起的癌細(xì)胞骨架重排及黏附能力的變化及其生物力學(xué)機(jī)制。
　　在本研究中，選用高轉(zhuǎn)移性的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為研究對(duì)象。首先從形態(tài)學(xué)上觀察隨著切應(yīng)力作用時(shí)間的增加，細(xì)胞面積更大，EF值更大。細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中，許多蛋白和細(xì)胞器會(huì)傾向于位于細(xì)胞前端來(lái)幫助細(xì)胞定向運(yùn)動(dòng)，高爾基體是其中之一。免疫熒光標(biāo)記GM130實(shí)驗(yàn)表明，切應(yīng)力作用1 h時(shí)，癌細(xì)胞極性無(wú)明顯變化，對(duì)比切應(yīng)力作用2 h組與static2 h組，切應(yīng)力組細(xì)胞極性明顯

3、增強(qiáng)。轉(zhuǎn)染EGFP-vinculin來(lái)標(biāo)記黏著斑，對(duì)比切應(yīng)力加載1 h組與FAK inhibitor組發(fā)現(xiàn)，切應(yīng)力一定程度上促進(jìn)黏著斑的形成。接著，臨床分析Cav-1與腫瘤惡性行為之間的關(guān)系，通過(guò)統(tǒng)計(jì)乳腺癌患者存活率發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Cav-1的患者存活率較低。選取細(xì)胞系MCF-7，U-2OS，EMT6以及HeLa，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) Cav-1的表達(dá)量與運(yùn)動(dòng)能力呈現(xiàn)正相關(guān)性。細(xì)胞骨架實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)沉默 Cav-1

4、后(shCav-1)，與對(duì)照組(shCtrl)相比，細(xì)胞生成應(yīng)力纖維較少，當(dāng)切應(yīng)力處理后，shCtrl組和shCav-1組應(yīng)力纖維都明顯增多。而用ROCK inhibitor(Y27632)處理MDA-MB-231細(xì)胞，骨架明顯破壞，再加載低切應(yīng)力后，細(xì)胞骨架發(fā)生重排，應(yīng)力纖維重新產(chǎn)生，并且切應(yīng)力也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞突出增多，有利于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。隨后，通過(guò)延時(shí)攝影觀察細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)對(duì)shCtrl組和shCav-1組，切應(yīng)力都能使得細(xì)胞形態(tài)快速變換

5、，因?yàn)榧?xì)胞的運(yùn)動(dòng)伴隨著形態(tài)的變化，因此切應(yīng)力促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。觀察細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡，Cav-1高表達(dá)組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)位移較大，運(yùn)動(dòng)速度較高。Western blot結(jié)果表明，在切應(yīng)力的加載下，沉默Cav-1導(dǎo)致Filamin A表達(dá)上調(diào)，Cofilin及p-MLC表達(dá)下調(diào)，相應(yīng)地，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力較弱。再貼壁實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cav-1的表達(dá)與剪切力都不利于癌細(xì)胞的再貼壁，在plastic，Collagen I，Matrigel上均有同樣的規(guī)律。進(jìn)一步研究發(fā)

6、現(xiàn)，Cav-1的表達(dá)使得Src，p-Src，F(xiàn)AK，p-FAK表達(dá)均較高，有利于癌細(xì)胞的黏附與運(yùn)動(dòng)。光漂白實(shí)驗(yàn)證實(shí)，沉默Cav-1后，黏著斑的運(yùn)動(dòng)速率較低，而細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)需要黏著斑不斷地動(dòng)態(tài)解聚與組裝，因此Cav-1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。最后，分別通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cav-1的表達(dá)不直接影響細(xì)胞增殖，凋亡以及周期，但是對(duì)于Cav-1高表達(dá)組，Src inhibitor和ROCK inhibitor能大幅降低癌細(xì)胞的存活率

7、。RT-PCR檢測(cè)integrin各亞型的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)切應(yīng)力的加載不會(huì)使得β1 integrin的mRNA表達(dá)改變，但是β1 inte grin會(huì)內(nèi)化進(jìn)細(xì)胞膜內(nèi)與Cav-1共定位。免疫熒光標(biāo)記active-β1 integrin，切應(yīng)力的短時(shí)間加載使得整體活化的整合素增多，長(zhǎng)時(shí)間又恢復(fù)至原水平。分析Z軸熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，5 min時(shí)，膜表面的活化整合素明顯較多，10 min時(shí)活化整合素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。
　　研究表明，在切應(yīng)力的處理下