生物材料表面吸附蛋白質(zhì)介導(dǎo)細胞粘附和生長的生物學(xué)信號通路研究.pdf

1、生物相容性是生物材料研究中的關(guān)鍵問題，而細胞在材料表面的粘附和生長情況是生物相容性評價的重要內(nèi)容。通常認為生物材料植入體內(nèi)或進行體外實驗時，首先在材料表面發(fā)生蛋白質(zhì)的吸附，然后發(fā)生細胞在材料表面的粘附和生長。而基因表達譜芯片和PCR芯片技術(shù)能幫助人們了解細胞內(nèi)基因的表達情況，深入研究與細胞粘附和生長相關(guān)的生物學(xué)通路，從分子水平解釋材料與細胞之間的相互作用。
　　本論文的目的是:(1)利用基因表達譜芯片研究殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖

2、膜表面PC12細胞的基因表達情況，并與本課題組前期的吸附蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果進行聯(lián)合分析，研究材料表面吸附蛋白質(zhì)對細胞基因組學(xué)的影響;(2)利用信號通路PCR芯片研究無涂層/氮化鈦涂層鎳鈦合金對內(nèi)皮細胞相關(guān)通路中基因表達情況，對本課題組前期發(fā)現(xiàn)的細胞粘附和生長過程中重要生物學(xué)信號通路進行驗證，研究材料表面吸附蛋白質(zhì)對細胞粘附的影響，綜合上述兩部分結(jié)果，對細胞粘附和生長的重要生物學(xué)信號通路進行研究，闡述材料表面吸附蛋白質(zhì)介導(dǎo)細胞粘附和生

3、長的分子機理。
　　本論文的具體工作如下:
　　1.利用勻膠法制備殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜，利用吖啶橙染色法和CCK-8實驗分別測定PC12細胞在這兩種材料和正常對照組表面的細胞形態(tài)和存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4h和24h兩個時間點，膠原蛋白/殼聚糖膜更有利于PC12細胞的粘附和形態(tài)鋪展;兩種材料表面培養(yǎng)4h時細胞存活率差異較小，在24h時膠原蛋白/殼聚糖膜表面細胞存活率明顯大于殼聚糖膜組，說明與殼聚糖膜相比，膠原蛋白/殼聚糖膜

4、促進PC12細胞的粘附和生長。
　　2.利用基因表達譜芯片研究殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜表面PC12細胞生長4h和24h后基因表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)殼聚糖膜組差異表達基因數(shù)量較多，通過RT-PCR實驗檢驗Pak1、Actn1、Bcar1、Akt1四個基因的表達情況與基因表達譜芯片實驗結(jié)果一致。此外，利用信號通路PCR芯片分別檢測無涂層/氮化鈦涂層鎳鈦合金表面人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)4h和24h后，“TGFβ/BMP信號通路”和“細胞骨架

5、調(diào)控信號通路”中相關(guān)基因的表達，結(jié)果表明，在這兩條信號通路中氮化鈦涂層鎳鈦合金表面內(nèi)皮細胞發(fā)生差異表達的基因更多。
　　3.利用DAVID功能注釋工具對殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜表面PC12細胞生長4h和24h后的差異表達基因進行GO功能分類分析，結(jié)果表明兩種材料主要參與生物學(xué)過程為細胞過程、代謝相關(guān)過程、細胞分化和發(fā)育等;分子功能主要包括核苷酸、DNA、蛋白質(zhì)等相關(guān)的分子功能等;細胞組分主要包括細胞內(nèi)相關(guān)的細胞組分功能、細胞膜

6、和細胞外相關(guān)的功能等。差異表達基因的生物學(xué)信號通路分析表明，材料與細胞作用后，主要影響細胞的粘著斑信號通路、肌動蛋白細胞骨架調(diào)控信號通路、胰島素信號通路、EGFR1信號通路。與本課題組前期吸附蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果進行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜表面吸附的血清蛋白質(zhì)作為配體與細胞表面受體結(jié)合后，通過細胞骨架跨膜連接將細胞外信號傳遞進入細胞內(nèi)，激活粘著斑、MAPK、PI3K等信號通路，參與粘著斑和肌動蛋白細胞骨架的組裝等

7、過程，通過以上生物學(xué)信號通路相互作用，膠原蛋白/殼聚糖膜更有利于PC12細胞的粘附和生長。
　　4.對無涂層/氮化鈦涂層鎳鈦合金表面人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長4h和24h后的差異表達基因進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“TGFβ/BMP信號通路”和“細胞骨架調(diào)控信號通路”兩條信號通路發(fā)生激活。與本課題組前期蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)結(jié)果聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)在細胞粘附階段，通過激活TGFβ信號通路增加整聯(lián)蛋白α/β亞基基因的表達，或通過含RGD序列的蛋白