生物材料表面吸附蛋白質(zhì)介導(dǎo)細(xì)胞粘附和生長的生物學(xué)信號通路研究.pdf

1、生物相容性是生物材料研究中的關(guān)鍵問題，而細(xì)胞在材料表面的粘附和生長情況是生物相容性評價(jià)的重要內(nèi)容。通常認(rèn)為生物材料植入體內(nèi)或進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先在材料表面發(fā)生蛋白質(zhì)的吸附，然后發(fā)生細(xì)胞在材料表面的粘附和生長。而基因表達(dá)譜芯片和PCR芯片技術(shù)能幫助人們了解細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)情況，深入研究與細(xì)胞粘附和生長相關(guān)的生物學(xué)通路，從分子水平解釋材料與細(xì)胞之間的相互作用。
　　本論文的目的是:(1)利用基因表達(dá)譜芯片研究殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖

2、膜表面PC12細(xì)胞的基因表達(dá)情況，并與本課題組前期的吸附蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析，研究材料表面吸附蛋白質(zhì)對細(xì)胞基因組學(xué)的影響;(2)利用信號通路PCR芯片研究無涂層/氮化鈦涂層鎳鈦合金對內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)通路中基因表達(dá)情況，對本課題組前期發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞粘附和生長過程中重要生物學(xué)信號通路進(jìn)行驗(yàn)證，研究材料表面吸附蛋白質(zhì)對細(xì)胞粘附的影響，綜合上述兩部分結(jié)果，對細(xì)胞粘附和生長的重要生物學(xué)信號通路進(jìn)行研究，闡述材料表面吸附蛋白質(zhì)介導(dǎo)細(xì)胞粘附和生

3、長的分子機(jī)理。
　　本論文的具體工作如下:
　　1.利用勻膠法制備殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜，利用吖啶橙染色法和CCK-8實(shí)驗(yàn)分別測定PC12細(xì)胞在這兩種材料和正常對照組表面的細(xì)胞形態(tài)和存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4h和24h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，膠原蛋白/殼聚糖膜更有利于PC12細(xì)胞的粘附和形態(tài)鋪展;兩種材料表面培養(yǎng)4h時(shí)細(xì)胞存活率差異較小，在24h時(shí)膠原蛋白/殼聚糖膜表面細(xì)胞存活率明顯大于殼聚糖膜組，說明與殼聚糖膜相比，膠原蛋白/殼聚糖膜

4、促進(jìn)PC12細(xì)胞的粘附和生長。
　　2.利用基因表達(dá)譜芯片研究殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜表面PC12細(xì)胞生長4h和24h后基因表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)殼聚糖膜組差異表達(dá)基因數(shù)量較多，通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)Pak1、Actn1、Bcar1、Akt1四個(gè)基因的表達(dá)情況與基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，利用信號通路PCR芯片分別檢測無涂層/氮化鈦涂層鎳鈦合金表面人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)4h和24h后，“TGFβ/BMP信號通路”和“細(xì)胞骨架

5、調(diào)控信號通路”中相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果表明，在這兩條信號通路中氮化鈦涂層鎳鈦合金表面內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生差異表達(dá)的基因更多。
　　3.利用DAVID功能注釋工具對殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜表面PC12細(xì)胞生長4h和24h后的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類分析，結(jié)果表明兩種材料主要參與生物學(xué)過程為細(xì)胞過程、代謝相關(guān)過程、細(xì)胞分化和發(fā)育等;分子功能主要包括核苷酸、DNA、蛋白質(zhì)等相關(guān)的分子功能等;細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞組分功能、細(xì)胞膜

6、和細(xì)胞外相關(guān)的功能等。差異表達(dá)基因的生物學(xué)信號通路分析表明，材料與細(xì)胞作用后，主要影響細(xì)胞的粘著斑信號通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控信號通路、胰島素信號通路、EGFR1信號通路。與本課題組前期吸附蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜表面吸附的血清蛋白質(zhì)作為配體與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，通過細(xì)胞骨架跨膜連接將細(xì)胞外信號傳遞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活粘著斑、MAPK、PI3K等信號通路，參與粘著斑和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組裝等

7、過程，通過以上生物學(xué)信號通路相互作用，膠原蛋白/殼聚糖膜更有利于PC12細(xì)胞的粘附和生長。
　　4.對無涂層/氮化鈦涂層鎳鈦合金表面人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長4h和24h后的差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“TGFβ/BMP信號通路”和“細(xì)胞骨架調(diào)控信號通路”兩條信號通路發(fā)生激活。與本課題組前期蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)結(jié)果聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞粘附階段，通過激活TGFβ信號通路增加整聯(lián)蛋白α/β亞基基因的表達(dá)，或通過含RGD序列的蛋白