痢疾桿菌效應蛋白調節(jié)宿主蛋白質泛素化信號途徑的結構生物學研究.pdf

1、痢疾桿菌是細菌性痢疾的病原菌，它能夠利用自身毒性質粒編碼的三型分泌系統(tǒng)向宿主細胞內分泌效應蛋白。效應蛋白以宿主細胞內的關鍵信號分子為靶標，調節(jié)細胞內的信號通路，以利于痢疾桿菌在宿主細胞內增殖轉移。蛋白質泛素化途徑是細胞內極其重要的一個翻譯后修飾途徑，因此也常常被效應蛋白作為攻擊目標。本文以痢疾桿菌效應蛋白OspI和IpaH3為研究對象，利用結構生物學的方法，解析效應蛋白調節(jié)宿主泛素化過程的分子機制。已有研究發(fā)現(xiàn)痢疾桿菌效應蛋白OspI能

2、夠使Ubc13的Gln100脫酰胺化，導致Ubc13失活，破壞了宿主細胞內的NF-kB信號通路。IpaH3作為一個泛素連接酶，能夠特異地結合共價連接有泛素的UbcH5c，在下游底物上連接形成K48的泛素鏈。但是，OspI-Ubc13與IpaH-UbcH5c間相互作用的分子機制仍是一個未解之謎。
　　本文通過原核表達系統(tǒng)高效表達了OspI及其宿主靶分子泛素結合酶Ubc13，并通過純化獲得二者的高純度重組蛋白，二者經(jīng)孵育后形成穩(wěn)定的效

3、應蛋白-宿主靶分子復合物。通過復合物結晶實驗，我們獲得了衍射分辨率為2.3埃的復合物晶體。通過結構分析，我們發(fā)現(xiàn)OspI通過兩個不同的表面電荷區(qū)與Ubc13的α1-螺旋、L1 loop和L2 loop相互作用，也進一步揭示了OspI的脫酰胺酶催化機制。
　　另外，我們通過原核表達系統(tǒng)，高效表達和純化獲得了IpaH3的重組蛋白，并且成功地在體外合成了Ub共價連接的泛素結合酶UbcH5c(UbcH5c～Ub)。然后，我們利用分子篩證明