催乳素免疫調節(jié)效應的研究及其信號傳導途徑的蛋白質組分析.pdf

1、目的：為探討催乳素／催乳素受體(PRL／PRLr)介導的免疫應答機制，本課題研究PRL對免疫應答基本過程的影響并對信號傳導途徑進行了整體性分析，前者進行三方面試驗，既分別測試催乳素刺激前后T細胞活化所需第二信號共刺激因子CDl54和CD28水平、細胞增殖能力及其免疫效應分子IFN-Y／IL一4分泌模式，后者通過蛋白組學分析，試圖了解催乳素在免疫細胞中的信號網(wǎng)絡系統(tǒng)。 方法：實驗一應用不同劑量的重組人催乳素(rhPRL)和植物血凝

2、素(PHA)單獨或聯(lián)合刺激人T淋巴白血病細胞株JurkatDl．1細胞，利用流式細胞儀檢測細胞表面(CD154和CD28分子的表達量；對不同時間點JurkatDl．1細胞表面CDl54和CD28分子的表達量進行測定。應用催乳素受體單克隆抗體(PRLrAb)阻斷催乳素的作用，分別比較JurkatDl．1細胞表面CDl54和CD28分子基礎表達量和rhPRL聯(lián)合PHA刺激組表達量在應用PRLrAb前后其各自呈現(xiàn)的變化。同時應用半定量RT一P

3、CR測定對照組、rhPRL聯(lián)合PHA刺激組和PRLrAb阻斷組JurkatDl．1細胞表面CD154和CD28分子mRNA的表達水平。實驗二應用臺盼藍拒染法通過倒置顯微鏡進行細胞計數(shù)以及利用MMT比色法酶標儀測定OD550，值來評估rhPRL對JurkatDl．1細胞增殖的影響。實驗三應用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測不同濃度rhPRL刺激JurkatDl．1細胞24小時后的細胞上清液中IFN—y和IL-4水平，并計算IFN-γ／IL

4、-4比值，籍此來反映Thl／Th2細胞因子平衡偏離的方向。實驗四應用磷酸化金屬親和層析法(PMAC)富集磷酸化蛋白并用單向凝膠電泳(1DE)分離，同時利用抗磷酸化酪氨酸抗體免疫沉淀法(IP)富集磷酸化酪氨酸，并用雙向凝膠電泳(2DE)分離。染色后通過凝膠掃描系統(tǒng)對不同組的蛋白質斑點或條帶進行分析，應用手工和自動挖膠系統(tǒng)獲取差異的蛋白質斑點或條帶。酶解后通過質譜分析并與蛋白質數(shù)據(jù)庫進行蛋白質匹配鑒定，由此鑒定出參與催乳素在JurkatDl

5、．1細胞內信號傳導的信號分子。 結果：單獨使用重組人催乳素(rhPRL)或者植物血凝素(PHA)并不能刺激Jurkatgl.1細胞表面CD154分子的表達，而在PHA誘導下rhPRL可以上調JurkatD1.1細胞表面CDl54分子的表達。這種效應在rhPRL濃度介于12．5ng／m卜200ng／m1呈現(xiàn)劑量依賴趨勢，rhPRL濃度在200ng／ml時CDl54分子的表達量最高為(28．63±8．05)％，與基礎表達量(10．8

6、3±3．76)％比較差別有顯著性意義。應用催乳素受體單克隆抗體(40ug／m1)阻斷催乳素的作用后，rhPRL(200ng／m1)聯(lián)合PHA組細胞表面CDl54分子的表達量從(46．60±M．8)％下調到(17．51±1．25)。％；而且基礎的表達量也從(21．37±7．38)％下調到(3．95±O．93)％，兩組差別在統(tǒng)計學上均有顯著性意義。半定量RT-PCR測定對照組、rhPRL聯(lián)合PHA刺激組和催乳素受體單克隆抗體組，細胞CDl5

7、4分子mRNA和內參B—actinmRNA的灰度比值分別為0．2207±0．005l、0．4190±0．0687和0．0938±O．0220．，各組之間的差別統(tǒng)計學上有顯著性意義。時效關系的結果提示細胞表面CDl54分子表達量從催乳素刺激后3小時就逐漸升高，12小時達到高峰，到48小時恢復接近基礎表達水平。流式細胞儀測定JurkatDl．1細胞表面CD28分子表達量和半定量RT一PCR測定CD28分子mRNA表達水平，結果均顯示rhPR

8、L并不影響CD28分子的表達。rhPRL濃度在Ong／ml-100ng／ml之間，JurkatD1.1細胞計數(shù)從(2．50±O．25)×10。／ml逐步增加到(13．93±1．21)×10。／ml，相對應的OD550，值從0．4643±O．0513逐步增加到1．2100±0．0183，呈現(xiàn)量效一致關系；IFN—γ劑量依賴性地從(34．34±0．47)pg/ml上升到(92．87±3．55)pg／ml，rhPRL濃度在100ng／ml-4

9、00ng／ml之間，各指標無明顯差別。在不同濃度的rhPRL組之間IL一4的分泌量沒有明顯的改變。信號轉導蛋白組學分析實驗中，磷酸化金屬親和層析法獲得的磷酸化蛋白用idg分離，膠掃描分析發(fā)現(xiàn)對照組和rhPRL刺激組之間存在五條明顯差別的條帶，其中三條條帶在rhPRL刺激組，兩條在對照組。質譜分析并與數(shù)據(jù)庫匹配，成功鑒定刺激組中一條條帶的蛋白質，為熱休克蛋白90(Hsp90)。免疫沉淀獲得磷酸化酪氨酸，經(jīng)過2DE分離，膠掃描分析后挖取rh

10、PRL刺激組九個點，質譜分析并與數(shù)據(jù)庫匹配，成功鑒定三個斑點的蛋白質分別是核內受體輔助抑制因子2變異體、半乳糖一卜磷酸尿苷酰轉移酶和鋅指蛋白ZIM3。 結論：1、單獨應用重組人催乳素刺激不能改變JurkatDl．1細胞表面共刺激分子CDl54的表達，只增加植物血凝素誘導下JurkatDl．1細胞表面CDl54分子的表達，提示催乳素對CD154表達僅為：誘導劑作用而非激活劑。這種效應在超生理濃度催乳素刺激下明顯，呈現(xiàn)一定的劑量及時

11、間依賴效應。2、內源性和外源性的催乳素都會影響JurkatDl．1細胞表面CDl54分子的表達。3、JurkatDl．1細胞表面CD28分子的表達并不受內源性和外源性催乳素的影響。4、單獨使用催乳素可以促進JurkatDl．1細胞的增殖。5、催乳素促進IFN-γ的分泌，促使Thl／Th2細胞因子向Thl細胞方向偏移。6、利用蛋白質組學研究細胞內信號轉導途徑是一種可行方法，它可以整體性研究參與信號傳導的信號分子。7、催乳素可以上調磷酸化熱