維生素D對ECM免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)及其機(jī)制的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　瘧疾廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，每年造成300多萬人感染，并導(dǎo)致60多萬人死亡。腦型瘧疾(CM)是惡性瘧原蟲感染最嚴(yán)重的并發(fā)癥，且是5歲以下兒童死亡的主要原因。導(dǎo)致人類CM發(fā)生的機(jī)制尚不十分清楚，瘧原蟲寄生的紅細(xì)胞(PRBCs)粘附至腦血管內(nèi)皮細(xì)胞引起腦微血管機(jī)械性梗阻被認(rèn)為是導(dǎo)致CM的病理機(jī)制。此外，以高水平炎性細(xì)胞因子為特點(diǎn)的過度炎癥反應(yīng)也被認(rèn)為有助于CM的發(fā)生。炎性細(xì)胞因子上調(diào)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子如ICAM-

2、I和VCAM-1的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞粘附和PRBCs在大腦的沉積。更好地了解CM的發(fā)生機(jī)制和明確CM有效的輔助治療策略是亟待解決的重要課題。
　　伯氏瘧原蟲（PlasmodiumbergheiANKA，P.bANKA）感染的鼠瘧模型疾病過程與P.f瘧疾感染的臨床表現(xiàn)有許多共同之處，是研究人類瘧疾疾病的最佳模型。研究表明，CM是腦血管內(nèi)感染紅細(xì)胞(parasitizedredbloodcells，pRBC)的黏附和細(xì)胞因子與效應(yīng)細(xì)

3、胞介導(dǎo)的宿主強(qiáng)烈前炎癥應(yīng)答的綜合效應(yīng)。相關(guān)研究表明活化T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答參與疾病誘導(dǎo)，并且CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞均有利于腦病變發(fā)生。事實(shí)上，Th1型免疫應(yīng)答在控制蟲血癥方面發(fā)揮關(guān)鍵作用的同時(shí)也促進(jìn)CM發(fā)生。
　　維生素D(Cholecalciferol，VD)是一種脂溶性維生素，暴露于紫外線或添加飲食后由皮膚合成。VD除了其經(jīng)典的調(diào)節(jié)骨和鈣磷代謝，在先天免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)也有明顯的調(diào)節(jié)功能。VD的免疫調(diào)節(jié)功能，特別是對

4、Th1型反應(yīng)的抑制作用，促使我們進(jìn)一步研究VD在實(shí)驗(yàn)性腦型瘧疾(ECM)中的作用。在嚙齒類動(dòng)物瘧疾模型中，有報(bào)道表明在伯氏瘧原蟲感染小鼠之前口服給予VD預(yù)防性治療兩周，可以降低小鼠感染率和延長生存期。然而，最近的一項(xiàng)研究表明，每周三次腹腔注射0.5μg/kgVD，對感染PbA的野生型小鼠沒有影響。為此，我們系統(tǒng)地研究了VD對ECM模型（P.bANKA感染C57BL/6小鼠）的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制，旨在為瘧疾的有效防治提供新的理論依據(jù)

5、。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1、收集患者血清
　　從緬甸東北部村莊采集56個(gè)無瘧疾感染并發(fā)癥的發(fā)熱病人（27例惡性瘧和29例間日瘧）。此外，10名健康志愿者作為對照組。獲得書面同意后，用內(nèi)壁覆有EDTA的真空采血管采集每個(gè)志愿者1ml的靜脈血。將血液以1000×g，5分鐘離心，收集血清，將其貯存在-80℃待檢測VD。根據(jù)制造商的說明，使用25(OH)D3的ELISA試劑盒(ImmundiagnostikAG,Bensheim

6、，Germany)，測定每個(gè)志愿者血清中的25(OH)D3的水平。樣品重復(fù)測定，取平均值。
　　2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理、感染及原蟲血癥觀察
　　VD處理:C57BL/6小鼠隨機(jī)分為6組:正常小鼠未感染(uninfected)，兩個(gè)PbA感染對照組(PbA)，PbA感染前補(bǔ)充VD組(VD+PbA)，PbA感染后補(bǔ)充VD組(PbA+VD)，和正常小鼠未感染，但給予VD治療作對照。VD+PbA組小鼠在PbA感染之前連續(xù)4天，每日灌胃給予

7、VD(50μg/kg)，而PbA+VD組小鼠在PbA感染48h之后開始連續(xù)4天，每日灌胃給予VD(10μg/kg、50μg/kg、250μg/kg)。兩對照組在VD+PbA和PbA+VD給藥的相同時(shí)間點(diǎn)給予相同體積的大豆油作為對照。在感染的第5天，收集血清，并使用25(OH)D3的ELISA試劑盒檢測25(OH)D3的含量。
　　小鼠感染:經(jīng)腹腔感染1×106P.bANKA寄生的紅細(xì)胞(pRBC)，感染不同時(shí)間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血，

8、制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。
　　3、小鼠血腦屏障通透性檢測
　　(1)于小鼠感染后第5天將各組小鼠靜脈注射200μl2％伊文思藍(lán)染料(2％Evansbluedye，EB，sigma公司)。
　　(2)1h后，心臟灌注生理鹽水至流出清亮液體為準(zhǔn)，然后取腦，拍照。
　　(3)將各組小鼠的腦放入離心管中，管內(nèi)加入1ml甲酰胺（sigma公司），37℃孵育48h。
　　(4)將各管取出，3

9、000rpm離心15min，取上清液200μl，放于96孔板中。
　　(5)630nm檢測OD值。
　　4、HE染色和免疫組化
　　PbA感染后第5天開始出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，對每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的五只小鼠進(jìn)行組織學(xué)檢查。用×400顯微鏡觀察ICAM-1，VCAM-1-，和CD36陽性血管，計(jì)數(shù)每只小鼠20個(gè)視野陽性血管的數(shù)量。小鼠大腦被固定在4％多聚甲醛中，然后石蠟包埋和切片，免疫組化(IHC)方法如下:
　　(1)石蠟切片，

10、常規(guī)脫蠟脫水。
　　(2)3％H2O2（無色液體）室溫孵育10分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。
　　(3)蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘。
　　(4)抗原修復(fù):枸櫞酸鈉緩沖液高壓修復(fù)方法。自然冷卻，再用PBS3分鐘×3次。
　　(5)血清封閉:37℃孵育30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。
　　(6)滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4℃過夜（最好復(fù)溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。
　　(7)滴加生物素

11、標(biāo)記的二抗，室溫或37℃孵育1小時(shí)。
　　(8)PBS沖洗，3分鐘×5次。
　　(9)滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘。
　　(10)PBS沖洗，3分鐘×5次。
　　(11)顯色劑顯色（DAB等）。
　　(12)自來水充分沖洗終止顯色。
　　(13)可進(jìn)行復(fù)染，脫水，透明。
　　(14)封片劑封片。
　　5、Real-timeRT-PCR
　　腦組織Tot

12、alRNA的提取及反轉(zhuǎn)錄:用Trizol按照說明書提取腦組織RNA，然后使用分光光度計(jì)測定濃度。用PrimeScriptTMRT試劑盒（Takara公司）去除基因組DNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為10μl，含有PrimeScriptTM緩沖液，PrimeScriptTMRT酶混合物，oligodT引物(50μM)和隨機(jī)引物兩種(100μM)及500ng總RNA。Real-time反應(yīng):用得到的cDNA作為模板和特定引物進(jìn)行

13、PCR反應(yīng)。使用SYBR(R)PremixExTaqTM試劑盒在ABI7500(ABI，USA)機(jī)器上進(jìn)行定量PCR（Takara公司）。反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性30秒，40個(gè)PCR循環(huán)（95℃5秒和60℃30秒）。采用2-△△CT法量化VD處理組與對照組的相對基因表達(dá)。
　　6、脾細(xì)胞培養(yǎng)
　　無菌取出感后第0、3、5天小鼠脾臟，用10％FCS-RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，1500rpm離心10min，用0.17

14、MNH4Cl裂解紅細(xì)胞，RPMI1640洗滌兩次。以含10％FCS-RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/ml，于24孔培養(yǎng)板中加入細(xì)胞懸液，500μl/孔，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。于37℃培養(yǎng)48h。350g室溫離心10min，收集上清，-80℃保存，待IFN-γ、TNF和IL-10檢測。
　　7、ELISA檢測
　　用ELISA試劑盒分別檢測血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α及IL-10的分泌水平。酶標(biāo)儀測定4

15、50nm處OD值。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SoftMaxPro4.3.1Ls軟件分析，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　8、流式細(xì)胞術(shù)
　　脾臟流式細(xì)胞術(shù):
　　無菌取出感染前（第0天）和感染后第3、5天小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，用0.17mol/LNH4C1裂解紅細(xì)胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/ml。DCs檢

16、測:每份樣品用抗CD11c-FITC單抗、抗CD11b-PE單抗、抗CD45R/B220-PerCP單抗和抗MHCⅡ-APC單抗進(jìn)行四色分析，另設(shè)陰性對照管，在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1ml，再加入抗CD11c-FITC單抗、抗CD11b-PE單抗和抗CD45R/B220-PerCP單抗進(jìn)行表面染色，離心去上清后，用0.5mlPBS重懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。TLR9檢測:每份樣品應(yīng)用F

17、ITC標(biāo)記的抗小鼠CD11c單抗和Biotin標(biāo)記的抗小鼠TLR9單抗進(jìn)行雙色分析，另設(shè)單標(biāo)CD11c單抗和TLR9單抗對照管。每管預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體2μl。然后用抗CD11c-FITC單抗進(jìn)行表面染色，4℃30min。每管加入2ml含2％FCS的PBS，1500rpm離心5min，棄上清，洗滌兩次。然后加入固定透膜夜250μl，4℃孵育1h。再加2ml1×wash固定透膜洗液，1500rpm離心5min洗滌1次，棄上清。加入

18、抗-TLR9-BiotinmAb進(jìn)行胞內(nèi)標(biāo)記，4℃孵育30min。每管加入2ml含2％FCS的PBS，1500rpm離心5min，棄上清，洗滌兩次。加入抗-Streptavidin-PE進(jìn)行胞內(nèi)標(biāo)記，4℃孵育30min。洗滌兩次，每管加入200μl2％多聚甲醛固定液重懸，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。TLR4檢測:每份樣品用抗CD11c-FITC單抗和抗TLR4-PE單抗雙色分析，另設(shè)陰性對照管。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色

19、管中加入脾細(xì)胞懸液0.1ml，離心去上清后，用0.5ml細(xì)胞染色緩沖液重懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。Th1檢測:每份樣品預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1ml，刺激5h后，再加入抗-CD4-FITC單克隆抗體，固定透膜后加入抗T-bet-PerCP和IFN-γ-PE單克隆抗體，染色30分鐘。離心去上清后，用0.5ml細(xì)胞染色緩沖液重懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。Tregs檢測:每份樣品用抗CD4-

20、FITC和抗CD25-PE單抗進(jìn)行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC單抗進(jìn)行胞內(nèi)染色，用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于0.5mlPBS中，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
　　腦組織流式細(xì)胞術(shù):
　　將小鼠處死，取出腦，用150目篩網(wǎng)研磨腦。然后加入到5ml含有100U/mlⅣ型膠原酶的RPMI1640中，42℃水浴45分鐘。300g離心10min，收集細(xì)胞沉淀，用30％Percoll重懸沉淀，然后加入到70％Perco

21、ll上層（用PBS配制），515g室溫離心30min。收集中間層，加入10mlPBS300g離心10min，然后標(biāo)記相應(yīng)的抗體:FITC-CD4、PerCP-CD8和APC-CD3。4℃染色30min，PBS洗滌細(xì)胞兩次，上機(jī)檢測，F(xiàn)lowjo軟件分析。
　　9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，標(biāo)本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較分析組內(nèi)和組間均值差異，采用Kaplan-Meyer方法進(jìn)行生存期分析。P＜0

22、.05為顯著差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、VD處理顯著升高P.bANKA感染C57BL/6小鼠血清中25(OH)D3水平
　　在感染后的第5天，正常對照組小鼠和PbA感染的小鼠VD水平相同。與未處理PbA感染組比較，兩個(gè)VD治療組25(OH)D3水平均顯著增高。我們還比較了健康人和瘧疾感染者血清中25(OH)D3水平。個(gè)體之間VD水平差別很大。健康人與急性惡性瘧和間日瘧患者25(OH)D3的均值(Kruskal-Wal

23、lisx2=3.13;P=0.2086)和平均對數(shù)轉(zhuǎn)換值(F=0.336;P=0.7160)沒有顯著差異。瘧疾患者血清25(OH)D3水平與健康對照組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、VD處理顯著防止P.bANKA感染C57BL/6小鼠CM的發(fā)生
　　對照組小鼠在感染后第5-6天開始出現(xiàn)明顯的腦瘧癥狀（如抽搐，皮毛豎起，顫抖，肢體癱瘓，痙攣，昏迷等神經(jīng)學(xué)癥狀），第6-7天小鼠開始死亡，在第11天全部老鼠死亡。對照組死亡的小鼠原蟲

24、血癥水平相對較低(＜12％)。給予大豆油的PbA感染組小鼠和未經(jīng)處理的感染對照組有相同的癥狀（病理學(xué)，生存期，或原蟲血癥）。PbA感染前或后給予VD(50μg/kg)治療均減少早期死亡率而且所有VD治療的小鼠存活時(shí)間超過感染后11天。相反，VD(50μg/kg)治療組小鼠在感染3周后因貧血和原蟲血癥死亡。出入意料的是，感染后補(bǔ)充VD有一個(gè)優(yōu)勢，PbA+VD組小鼠存活時(shí)間長于VD+PbA組。此外，PbA+VD組小鼠原蟲血癥水平低于VD+P

25、bA組。因此，我們對PbA+VD組的病理和免疫學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
　　3、VD處理顯著改善實(shí)驗(yàn)性腦瘧的病理改變
　　在小鼠感染后第5天，當(dāng)小鼠出現(xiàn)腦瘧癥狀時(shí)取腦。與正常小鼠相比，組織學(xué)檢查顯示，PbA+VD組顯微鏡下每個(gè)視野白細(xì)胞沉積的血管數(shù)明顯低于對照組。免疫組化發(fā)現(xiàn)，PbA+VD組微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的VCAM-1，ICAM-1和CD36明顯少于對照組。同時(shí)，PbA組血腦屏障的完整性破壞明顯，有較高水平的EB外滲。相比之

26、下，VD治療明顯減少腦組織的EB滲出。
　　4、VD處理顯著減少T細(xì)胞向腦組織遷移
　　在小鼠感染后第5天，分離腦單核細(xì)胞并檢測CD8+和CD4+T細(xì)胞的量。與未感染的正常小鼠相比，PbA感染CD8+和CD4+T細(xì)胞的量顯著增多。與此相反，PbA感染后VD治療組小鼠腦T細(xì)胞群的數(shù)量與未感染正常小鼠比較沒有顯著差異。為此，我們還對VD治療組和對照組腦組織CXCL9和CXCL10的mRNA表達(dá)進(jìn)行比較。在感染后第5天，VD治療顯

27、著降低腦組織中趨化因子的表達(dá)。
　　5、VD抑制Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答
　　PbA感染小鼠第5天血清中IFN-γ和TNF水平顯著增加，脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的這些細(xì)胞因子也顯著增加。而VD治療組血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的這兩種細(xì)胞因子水平明顯降低。此外，與對照組比較，VD治療組小鼠在感染后第5天腦組織中IFN-γ和TNF的mRNA表達(dá)顯著降低。同時(shí)，與感染前相比，對照組Th1型細(xì)胞（CD4+T-bet+IFN-γ+細(xì)胞）的數(shù)量在感染后第

28、3、5天顯著升高。然而，在感染后第5天，VD治療組小鼠脾細(xì)胞中Th1型細(xì)胞所占比例明顯降低。
　　6、VD處理提高Tregs數(shù)量并增加IL-10分泌
　　在小鼠感染后第3天，與對照組比較，PbA+VD組Tregs的數(shù)量顯著升高。此外，與對照組相比，PbA+VD組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10的分泌水平升高。同時(shí)，感染后第5天PbA+VD組小鼠血清中IL-10水平也顯著增加。
　　7、VD下調(diào)DCs數(shù)量
　　在小鼠感染

29、后第5天，對照組髓樣DCs(mDCs)和漿樣DCs(pDC)數(shù)量明顯高于PbA+VD組。在感染后第5天，PbA+VD組DCs共刺激分子MHCⅡ表達(dá)降低。此外，感染第5天，PbA+VD組DCs表面分子TLR4和胞內(nèi)TLR9的表達(dá)也降低。
　　結(jié)論
　　我們的研究表明，VD在ECM發(fā)生過程中具有抗炎癥作用。更重要的是，我們的結(jié)果證實(shí)VD通過影響脾臟DCs數(shù)量，減少炎癥細(xì)胞因子IFN-γ，TNF以及趨化因子CXCL9，CXCL10