維生素D缺乏對脊柱結(jié)核相關(guān)免疫指標(biāo)的影響研究.pdf

1、目的：
　　 1、觀察VD缺乏對脊柱結(jié)核患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群及調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞Treg分布的影響情況；觀察VD缺乏對IL-2、IL-10表達(dá)的影響情況。
　　 2、觀察VD缺乏對脊柱結(jié)核局部病灶中IFN-γ、TGF-β、IL-10及TNF-α表達(dá)的影響。
　　 3、初步探討VD缺乏對脊柱結(jié)核免疫功能影響的可能機(jī)制，為進(jìn)一步的臨床試驗提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、實驗對象的

2、選擇
　　 在2010年1月至2011年12月于西南醫(yī)院骨科接受手術(shù)治療的脊柱結(jié)核病人中選取合適對象作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)為：1、確診脊柱結(jié)核；2、初治結(jié)核；3、營養(yǎng)狀況正常；4、長期居住地重慶；5、無外地居住史；6、漢族；7、年齡；8、在16歲-65歲；9、有接種史；排除標(biāo)準(zhǔn)為：1、復(fù)發(fā)結(jié)核；2、白蛋白及血鈣磷水平低于正常范圍；3、有肝腎病史；4、甲狀腺或甲狀旁腺病史；5、血VD水平在25nmol/L至50nmol/L之間。最終

3、入組109例。
　　 選取年齡分布同研究組相近、血白蛋白、血鈣磷水平在正常范圍、無肝腎功能異常、無結(jié)核病史的健康獻(xiàn)血者為對照組，共40例。
　　 2、VD水平的測定及研究對象分組
　　 采用ELISA方法測定研究組、對照組外周血VD水平，在研究組中，VD水平高于50nmol/L為VD正常組，低于25nmol/L為VD缺乏組。按術(shù)中所見的病灶情況及影像學(xué)特點將研究組的病變程度分為增生型與干酪型兩種類型，卡方檢驗分析

4、病變類型構(gòu)成比的組間差異。
　　 3、外周血相關(guān)免疫指標(biāo)的檢測分析
　　 采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群及調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+Treg的分布，采用ELISA方法測定細(xì)胞因子IL-2、IL-10的表達(dá)，采用單因素方差分析各指標(biāo)的組間差異。
　　 4、局部病灶相關(guān)免疫指標(biāo)的檢測分析
　　 VD正常組和VD缺乏組通過手術(shù)取得病灶標(biāo)本后，將膿液進(jìn)行涂片、HE染色、IL-

5、10和TNF-α免疫組化染色；將死骨進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色；將膿壁肉芽組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色、IFN-γ、TGF-β、IL-10和TNF-α免疫組化染色。觀察局部病灶的形態(tài)學(xué)特點，分析各細(xì)胞因子在兩組病灶中的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、研究組109例中，外周血VD水平高于50nmol/L為VD正常組，有48例，低于25nmol/L為VD缺乏組，有61例。
　　 2、對照組(n=40)血清V

6、D水平為64.7±5.72 nmol/L，VD正常組(n=48)血清VD水平為61.9±5.48 nmol/L，VD缺乏組(n=61)血清VD水平為20.5±3.67 nmol/L，VD正常組與對照組血清VD水平無顯著差異，VD缺乏組血清VD水平顯著低于其他兩組(P<0.01)。VD缺乏組病人中，病變類型屬于干酪型的比例85.2%(52/61)較VD正常組39.6%(19/48)高，差異顯著(P<0.01)。
　　 3、三通道流

7、式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果：①VD缺乏組CD4+T淋巴細(xì)胞亞群百分比為(38.18±3.64)%，顯著高于VD正常組(35.92±3.47)%和對照組(35.61±2.95)%(P<0.05)：VD缺乏組CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分比為(43.16±2.76)%，顯著高于VD正常組(31.21±1.60)%和對照組(28.93±1.70)%(P<0.01)；VD缺乏組CD4+/CD8+比值0.90±0.08，顯著低于VD正常組1.26±0.10和對

8、照組1.30±0.12(P<0.01)。VD正常組與對照組無顯著差異；②VD缺乏組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群占CD4+淋巴細(xì)胞百分比為(3.92±0.67)%，顯著低于VD正常組(6.03±0.69)%和對照組(5.41±0.86)%(P<0.05)。
　　 ELISA方法檢測結(jié)果：①VD缺乏組血IL-2水平為67.42±6.23ng/L，顯著高于VD正常組58.63±5.87ng/L和對照組56.35±7.

9、55ng/L(P<0.05)；②VD缺乏組血IL-10水平為12.63±2.20ng/L，顯著低于VD正常組20.05±3.15ng/L和對照組18.48±2.90ng/L(P<0.01)；
　　 4、免疫組化染色觀察結(jié)果：①VD缺乏組膿液涂片IL-10表達(dá)較VD正常組低，TNF-α表達(dá)較VD正常組高，差異顯著(P<0.05)；②VD缺乏組膿壁肉芽組織石蠟切片IL-10、TGF-β表達(dá)較VD正常組低，IFN-γ、TNF-α表達(dá)較

10、VD正常組高，差異顯著(P<0.05)。
　　 討論：
　　 1、VD缺乏與脊柱結(jié)核干酪型病變密切相關(guān)。
　　 2、VD缺乏可使機(jī)體出現(xiàn)IL-2/IL-10比例失調(diào)，提示VD缺乏可能引起Th1/Th2失衡。
　　 3、VD缺乏間接造成CD4+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比增加，并大量激活具有細(xì)胞毒性作用的CD8+T細(xì)胞，CD4+/CD8+比例倒置，使機(jī)體組織受到CD8+T細(xì)胞毒性作用的損傷。
　　 4、V

11、D缺乏使介導(dǎo)Th2分泌IL-10上調(diào)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的通路受到抑制，Th2型反應(yīng)減弱，Th1型反應(yīng)增強(qiáng)，Th1/Th2平衡向Th1偏移，導(dǎo)致免疫損傷效應(yīng)出現(xiàn)。
　　 5、VD缺乏使TNF-α過度表達(dá)，造成局部炎癥反應(yīng)，TGF-β低表達(dá)抑制肉芽組織纖維結(jié)構(gòu)形成，減弱局部肉芽組織對結(jié)核菌的限制作用。
　　 6、VD缺乏脊柱結(jié)核局部病變IFN-γ與TNF-α過度表達(dá)，而IL-10、TGF-

12、β低表達(dá)，出現(xiàn)細(xì)胞因子表達(dá)的嚴(yán)重失調(diào)，啟動細(xì)胞毒性損傷機(jī)制。導(dǎo)致局部干酪壞死為主的免疫損傷效應(yīng)。
　　 7、VD缺乏導(dǎo)致機(jī)體免疫保護(hù)和免疫損傷失衡，免疫損傷作用增強(qiáng)，而免疫保護(hù)作用減弱，造成脊柱局部組織的過度損傷、病變程度加重，實驗結(jié)果提示補(bǔ)充VD可能促進(jìn)免疫平衡恢復(fù)，利于脊柱結(jié)核病變修復(fù)。
　　 結(jié)論：
　　 1、VD缺乏可能引起Th1/Th2平衡向Th1偏移，表現(xiàn)為Th1細(xì)胞亞群過度活化，Th2細(xì)胞亞群抑制，