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文檔簡介
1、在外科臨床嚴(yán)重創(chuàng)傷修復(fù)和手術(shù)治療中常需要血管移植物,自體血管取材受限,但是小于5mm直徑的人工血管或在血流速度較慢的大口徑應(yīng)用的人工血管早期即易形成血栓。組織工程血管(TEBVs)是研究的方向之一,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是重要的種子細(xì)胞來源。目前TEBVs研究的瓶頸是種子細(xì)胞在體內(nèi)流體切應(yīng)力作用下粘附和功能不理想,容易出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、脫落,使移植失敗,但是目前尚沒有流體切應(yīng)力對TEBVs種子細(xì)胞BMSCs活性功能影響的研究報(bào)道。因
2、此研究流體切應(yīng)力對TEBVs種子細(xì)胞BMSCs生物學(xué)功能的影響及其分子機(jī)制,對TEBVs構(gòu)建具有重要的意義。
目的
1.研究出切應(yīng)力對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡及活性的影響。
2.明確在流體切應(yīng)力對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能活性影響的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和相關(guān)基因,找到改進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能的基因靶點(diǎn)。
3.研究出流體切應(yīng)力對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能活性影響的分子機(jī)制,為改進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為TEBVs種子細(xì)胞的
3、功能奠定基礎(chǔ)。
方法
1.采用傳統(tǒng)的梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs),經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面特征CD分子鑒定,并將其誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞,并采用骨鈣素免疫組化染色和油紅O染色進(jìn)行鑒定。
2.對第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別給予3、10和30dyne/cm2的流體切應(yīng)力2h,6h,24h,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞增殖曲線,應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察增殖及凋亡,檢測Caspase3活性和hBMSCs釋
4、放的LDH活性。
3.對給予3dyne/cm2切應(yīng)力6h的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的蛋白質(zhì)采用二維凝膠電泳,以靜態(tài)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為對照,將發(fā)生差異的蛋白質(zhì)予以質(zhì)譜分析,同時(shí)用免疫熒光染色和westernblotting的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。
4.將3dyne/cm2切應(yīng)力作用6h后的hBMSCs為實(shí)驗(yàn)組,以靜態(tài)培養(yǎng)的hBMSCs為對照組,通過黏附基因芯片采用OligoGEARRay基因芯片實(shí)驗(yàn)方法和通過凋亡基因芯片采用O
5、ligoGEARRay基因芯片實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行對照研究,并應(yīng)用rt-PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果,以尋找切應(yīng)力下hBMSCs變化的關(guān)鍵基因。
5.對hBMSCs施加不同流體切應(yīng)力,觀察細(xì)胞增殖、凋亡和活性功能同時(shí),針對切應(yīng)力下hBMSCs凋亡信號傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵基因應(yīng)用外源性抑制劑重組基因cIAP1干預(yù)和cIAP1拮抗劑DIABLO反向干預(yù),研究切應(yīng)力下影響hBMSCs活性功能的機(jī)制。
結(jié)果
1.所獲得的細(xì)胞符合骨髓間
6、充質(zhì)干細(xì)胞特征,hBMSCs的表面抗原分子CD29和CD105陽性,CD45、CD34和CD14均為陰性。骨鈣素免疫組化染色和油紅O染色均呈陽性,可證明能夠定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。
2.3dyne/cm2切應(yīng)力下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2h和6h時(shí),細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化,G2+S期的細(xì)胞百分比顯著增高,hBMSCs發(fā)生凋亡壞死顯著。而3dyne/cm2切應(yīng)力和10dyne/cm2切應(yīng)力作用24h時(shí),可見平板流動腔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減
7、少,30dyne/cm2切應(yīng)力作用下,細(xì)胞發(fā)生顯著脫落,作用時(shí)間越長細(xì)胞脫落越顯著,hBMSCs在各組切應(yīng)力作用6h時(shí)即發(fā)生顯著的凋亡、壞死。各切應(yīng)力作用2h時(shí)和3dyne/cm2切應(yīng)力作用6h時(shí)hBMSCs中Caspase3活性活性和LDH活性均未發(fā)生顯著變化;在10dyne/cm2切應(yīng)力及30dyne/cm2切應(yīng)力作用6h時(shí),hBMSCs的Caspase3活性和LDH活性顯著增加。
3.蛋白組學(xué)研究成功鑒定出切應(yīng)力作用于h
8、BMSCs后差異蛋白質(zhì)點(diǎn)32個(gè),其中蛋白質(zhì)表達(dá)顯著上調(diào)有10種,蛋白質(zhì)表達(dá)顯著下調(diào)有3種。其中經(jīng)免疫熒光染色和westernblotting顯示GAPDH和AnnexinA2表達(dá)確實(shí)顯著上調(diào)。
4.通過對3dyne/cm2切應(yīng)力作用6h后的hBMSCs基因芯片研究結(jié)果顯示,有6種在切應(yīng)力作用下顯著變化的黏附基因,其中4種基因表達(dá)上調(diào)超過2倍,分別為ECM-1、ICAM-1、cSPG7、TIMP2;2種基因表達(dá)下調(diào)超過2倍,分別
9、為LAMA4和VCAM1。同時(shí)有5種在切應(yīng)力作用下顯著變化的凋亡基因,其中有2種表達(dá)顯著上調(diào)超過2倍的凋亡基因分別為APAF1和BOK。對基因芯片發(fā)現(xiàn)的6種顯著變化的粘附基因和5種顯著變化的凋亡基因進(jìn)行了rt-PCR檢測,顯示基因ECM-1、ICAM-1、cSPG7、TIMP2顯著增高(P<0.001和P<0.01),而基因LAMA4和VCAM1顯著降低(P<0.001),基因APAF1和BOK顯著增高(P<0.001和P<0.01),
10、從而驗(yàn)證了基因芯片的準(zhǔn)確性。3dyne/cm2切應(yīng)力作用2h后,hBMSCscIAP1水平升高(P<0.05),但30dyne/cm2切應(yīng)力作用后,hBMSCscIAP1水平均降低(P<0.05)。
5.應(yīng)用Caspase抑制劑外源性重組cIAP1干預(yù)Caspase3的活性和LDH活性均降低,hBMSCs的凋亡減少,細(xì)胞增殖增加。加入cIAP1抑制劑DIABLO反向干預(yù)后,Caspase3活性和LDH活性增強(qiáng),細(xì)胞凋亡顯著增加
11、。
結(jié)論
1.首先研究發(fā)現(xiàn)低切應(yīng)力(3dyne/cm2)作用較短時(shí)間(≤6h)時(shí)可促進(jìn)hBMSCs增殖,hBMSCs未發(fā)生顯著凋亡,同時(shí)內(nèi)源性cIAP1上調(diào);但在3dyne/cm2作用12h和10dyne/cm2以及30dyne/cm2流體切應(yīng)力下6h時(shí)hBMSCs增殖受到抑制,細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡壞死,活性功能明顯減低。切應(yīng)力越大細(xì)胞凋亡壞死越顯著。為hBMSCs種子細(xì)胞在體外應(yīng)用切應(yīng)力預(yù)適應(yīng)、改善種子細(xì)胞的活性功能打
12、下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
2.蛋白質(zhì)組學(xué)研究和基因芯片的篩選,首先發(fā)現(xiàn)3dyne/cm2的切應(yīng)力作用6h后hBMSCs細(xì)胞AnnexinA2和GAPDH表達(dá)顯著上調(diào),有6種粘附相關(guān)基因及5種凋亡相關(guān)基因發(fā)生顯著變化,其中凋亡相關(guān)基因APAF1和BOK在切應(yīng)力作用下顯著增強(qiáng),顯示hBMSCs在切應(yīng)力作用下凋亡與APAF1、BOK和Caspase凋亡基因的啟動相關(guān)。為進(jìn)一步改進(jìn)種子細(xì)胞功能提供了基因靶點(diǎn)。
3.應(yīng)用Caspase9抑
13、制劑干預(yù)可降低Caspase3的活性和LDH活性,減少hBMSCs的凋亡,細(xì)胞增殖增加;加入cIAP1拮抗劑反向干預(yù)后Caspase3活性和LDH活性增強(qiáng),細(xì)胞凋亡顯著增加。從而首先實(shí)驗(yàn)證實(shí)hBMSCs在切應(yīng)力作用下是通過激活了凋亡信號通路機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,出現(xiàn)hBMSCs活性功能下降。
4.首先應(yīng)用外源性重組cIAP1干預(yù)可以實(shí)現(xiàn)抑制Caspase3的活性和LDH活性,減少hBMSCs在切應(yīng)力作用下的凋亡,使細(xì)胞增殖和活性增
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