鴨源cathelicidin的分子克隆及體外生物學(xué)功能研究.pdf

1、Cathelicidin是廣泛存在于脊椎動物體內(nèi)的一類抗微生物多肽，整個(gè)肽包括信號肽、高度保守的cathelin域和功能肽，因其具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在整個(gè)抗菌肽家族中單獨(dú)形成一支。目前，哺乳動物、魚類、兩棲動物、鳥類等均有cathelicidin的發(fā)現(xiàn)，且越來越多的cathelicidin正在被發(fā)現(xiàn)與研究。研究證明，cathelicidin除了具有高效廣譜抑菌活性外、還具有免疫調(diào)節(jié)活性，是機(jī)體免疫體系不可或缺的一部分，同時(shí)cathelic

2、idin還具有抑制組織損傷并促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)血管生成、結(jié)合內(nèi)毒素等功能，具有廣闊的研究價(jià)值與應(yīng)用前景。
　　在本試驗(yàn)中，以紹鴨為試驗(yàn)對象，通過基因克隆的方法首次獲得了鴨源cathelicidin抗菌肽基因編碼全序列，并對該肽dCATH的序列特點(diǎn)與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、體外生物學(xué)活性、二級結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制等進(jìn)行了研究與探討。
　　根據(jù)原雞、鵪鶉、環(huán)頸雉、鴿子等禽類cathelicidin基因的序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一系列特異性引物，采用3'

3、RACE-PCR的方法獲得了鴨cathelicidin的全基因編碼序列，整個(gè)開發(fā)閱讀框?yàn)?41 bp，編碼146個(gè)氨基酸，由17個(gè)氨基酸的信號肽、98個(gè)氨基酸的cathelin域和20個(gè)氨基酸的功能多肽組成，其中預(yù)測的功能肽dCATH序列為KRFWQLVPLAIKIYRAWKRR。通過序列對比與進(jìn)化樹分析獲知，dCATH與其他禽源物種的cathelicidin前體肽具有較高的同源性，但功能肽差異較大，表明dCATH基因在進(jìn)化過程中與其他

4、禽源cathelicidin基因具有一定親緣關(guān)系，可能來自于一個(gè)共同的祖先，而功能肽的差異可能因?yàn)椴煌奈锓N面臨的病原微生物不同，而向著不同的方向進(jìn)化。
　　CD圓二色譜測定dCATH以α螺旋結(jié)構(gòu)為主。抑菌試驗(yàn)表明dCATH對8種代表性測試菌具有高效的殺菌活性，平均MICs為4μM，對大腸桿菌MIC值甚至達(dá)到2μM。dCATH對哺乳動物細(xì)胞的損傷作用通過人紅細(xì)胞和HaCat細(xì)胞檢測，發(fā)現(xiàn)dCATH在低濃度下，毒性較小，隨著濃度增加

5、，肽對哺乳動物細(xì)胞的損傷程度也大幅度增強(qiáng)，但是，培養(yǎng)基中加入10％胎牛血清會明顯降低肽的溶血活性。dCATH具有良好的鹽離子和熱穩(wěn)定性，陽離子和高溫處理對肽的活性影響極小;但是酶穩(wěn)定性稍弱，試驗(yàn)中選定的四種酶均會影響肽的活性，其中在木瓜蛋白酶和蛋白酶K處理后，dCATH的MIC＞128μM。dCATH的抑菌機(jī)制的研究主要集中在細(xì)菌胞膜上，通過內(nèi)外膜通透性、內(nèi)膜去極化、掃描與透射電子顯微鏡等試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)dCATH同大多數(shù)肽一樣，能夠改變內(nèi)外