飛蝗GFAT和GNA的分子特性及生物學(xué)功能研究.pdf

1、幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)表皮及圍食膜的重要成分，許多酶參與幾丁質(zhì)的合成。研究昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成途徑關(guān)鍵酶的生物學(xué)功能，對(duì)于解析昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成機(jī)制具有重要意義。本文選擇了飛蝗幾丁質(zhì)合成途徑的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)胺酶(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase，GFAT)和葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase，GN

2、A），對(duì)這兩個(gè)酶的序列特征，表達(dá)特性和生物學(xué)功能等進(jìn)行了研究。
　　我們從飛蝗EST數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GFAT基因的部分cDNA片段，采用5'-RACE技術(shù)獲得飛蝗GFAT的5'端序列，通過(guò)拼接得到了飛蝗GFAT的cDNA全長(zhǎng)。該序列長(zhǎng)3202bp，開(kāi)放閱讀框ORF為2292bp，編碼764個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為85.6kD。序列分析表明飛蝗GFAT與其他已知昆蟲(chóng)的GFAT蛋白具有較高的序列一致性，但是飛蝗GFAT蛋白N-端多出74個(gè)氨基

3、酸。GFAT的催化位點(diǎn)在真核生物與原核生物中都很保守。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)表明飛蝗GFAT含有5個(gè)PKA磷酸化位點(diǎn)S271、S326、S380、S567和S581，可能與PKA及AMPK的磷酸化調(diào)節(jié)有關(guān)?；谝阎锓NGFAT全長(zhǎng)氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明昆蟲(chóng)GFAT按物種親緣關(guān)系依次聚類(lèi)，哺乳動(dòng)物GFAT1和GFAT2形成兩個(gè)獨(dú)立的分支。飛蝗GFAT的mRNA表達(dá)分析表明，GFAT在飛蝗表皮中表達(dá)量最高，其次是脂肪體和翅芽;飛蝗GFA

4、T在5齡表皮的發(fā)育表達(dá)圖譜表明，GFAT在5齡初期表達(dá)量最高，隨后逐漸降低。5齡飛蝗GFAT的mRNA被干擾后，93％的若蟲(chóng)在蛻皮過(guò)程中出現(xiàn)蛻皮困難而死亡的表型。上述研究表明:飛蝗GFAT參與了飛蝗表皮幾丁質(zhì)的合成，并可能受磷酸化和UDP-N-乙酰葡萄糖胺的反饋抑制調(diào)節(jié)。
　　采用生物信息學(xué)方法，在飛蝗EST數(shù)據(jù)庫(kù)中得到飛蝗GNA的cDNA序列，全長(zhǎng)1230 bp，開(kāi)放閱讀框ORF為612 bp，編碼204個(gè)氨基酸。飛蝗GNA與其

5、他物種GNA的氨基酸序列一致性很高，結(jié)合底物GlcN6P的氨基酸殘基完全一致?；趐ET-28a(+)質(zhì)粒構(gòu)建飛蝗GNA重組蛋白原核表達(dá)載體，在大腸桿菌E coli BL21(DE3)菌株中成功表達(dá)飛蝗GNA重組蛋白，經(jīng)過(guò)Ni-NTA親和柱純化得到單一目的條帶，飛蝗GNA重組蛋白的酶學(xué)特性研究表明飛蝗GNA重組蛋白的最適反應(yīng)溫度為37-50℃，最適pH為8.0-9.5;測(cè)定了飛蝗重組GNA的Km值，當(dāng)D-GlcN6P的濃度為200μM時(shí)

6、，Acetyl-CoA的Km=133.60μM;當(dāng)Acetyl-CoA的濃度為200μM時(shí)，D-GlcN6P的Km=42.43μM。飛蝗GNA組織特異性分析顯示其在表皮、脂肪體及肌肉中表達(dá)量較高;飛蝗5齡表皮的發(fā)育變化表明，GNA在剛蛻皮后的表達(dá)量最高，之后逐步降低;飛蝗GNA的RNA干擾結(jié)果顯示:GNA的表達(dá)能夠被有效沉默，但蛻皮及發(fā)育未受影響。飛蝗GNA被干擾后未觀察到對(duì)飛蝗蛻皮及發(fā)育產(chǎn)生影響，因此，推測(cè)可能存在N-乙酰葡萄糖胺激酶