E2F1調(diào)控microRNAs對食管鱗癌細胞生物學功能的影響及機制研究.pdf

1、食管癌是全世界范圍內(nèi)致死率第六位的惡性腫瘤，可以分成兩種主要的類型，即食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌(esophagealadenocarcinoma，EA)，在中國主要的食管癌類型是食管鱗癌。近年來食管鱗癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，但其預后卻不樂觀，同時食管鱗癌的術(shù)后5年生存率居高不下。因此研究其發(fā)病機制，尋找早期診斷及治療的靶點顯得尤為重要。
　　作為DN

2、A損傷反應重要的效應原件之一，轉(zhuǎn)錄因子E2F1因為能夠參與調(diào)控DNA損傷反應過程中的細胞周期G1/S阻滯和細胞凋亡過程，近年來在DNA損傷反應中的地位越來越突出。
　　E2F1是轉(zhuǎn)錄因子E2Fs家族中的一員，E2Fs是腫瘤抑制因子pRb的下游效應因子，決定了眾多進入并通過細胞周期S期基因的順序表達。深入探討E2F1在食管鱗癌中的功能及其具體機制具有重要的意義。
　　微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類長度為2

3、1-23nt的非編碼小RNAs，在轉(zhuǎn)錄后水平負向調(diào)控基因的表達。E2F1上調(diào)的miRNAs，可以反過來通過直接靶向或者間接抑制E2F1的表達作為E2F1通路的負反饋調(diào)控因子，維持細胞穩(wěn)態(tài)。此外，在DNA損傷反應中，miRNAs既可以靶向調(diào)控DNA損傷反應通路的相關(guān)基因ATM、ATR、Chk1，Chk2等，同時又可以被這些基因包括E2F1所轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)在miR-203基因和miR-26b的主基因CTDSP

4、1的啟動子區(qū)CpG島內(nèi)存在E2F1的結(jié)合位點，它們可能受到E2F1的調(diào)控。本課題旨在探討食管鱗癌細胞中E2F1調(diào)控miR-203和miR-26b表達的分子機制，以及他們在食管鱗癌細胞生長和DNA損傷反應中的功能。
　　本課題的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.順鉑對食管鱗癌細胞中miR-203的誘導作用依賴于E2F1的表達
　　1.1、采用Western blot和qRT-PCR的方法檢測順鉑作用于食管鱗癌細胞后，γ-

5、H2X和E2F1的表達，以及miR-203表達的時間效應和濃度梯度效應。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，順鉑處理食管鱗癌細胞EC109和Kyse450后，γ-H2X的表達增加，說明發(fā)生了DNA損傷反應。在E2F1蛋白表達上調(diào)的同時，miR-203的表達也相應升高。此外，順鉑對miR-203的誘導作用具有時間和濃度梯度效應。研究結(jié)果提示miR-203在順鉑誘導的食管鱗癌細胞DNA損傷反應中表達增加，而這種表達效應可能與E2F1的表達相關(guān)。
　　1.2、分

6、別采用Western blot和qRT-PCR的方法檢測在食管鱗癌細胞中過表達或者干擾E2F1的表達后，E2F1和miR-203的表達變化。實驗結(jié)果顯示，在食管鱗癌細胞EC109和Kyse450中過表達E2F1后，miR-203表達增加。而干擾食管鱗癌細胞EC109和Kyse450中E2F1的表達后，在E2F1表達降低的同時，γ-H2X的表達降低，說明順鉑誘導的DNA損傷反應與E2F1的表達相關(guān)。更重要的是，E2F1的表達降低阻斷了順鉑

7、對miR-203的誘導作用。這些結(jié)果證明在食管鱗癌細胞中順鉑對miR-203的誘導作用是由E2F1介導的。
　　1.3、通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灪虲hIP實驗研究E2F1對miR-203的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及相關(guān)機制。通過生物信息學的方法，我們在miR-203轉(zhuǎn)錄起始位點上游發(fā)現(xiàn)三個潛在的E2F1結(jié)合位點，分別是-501/-486(BS1)、-439/-449(BS2)和-202/-194(BS3)。熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示過表達E2F1顯

8、著上調(diào)含有三個結(jié)合位點的報告基因載體的轉(zhuǎn)錄活性，缺失BS2后，熒光素酶的結(jié)合活性幾乎完全消失。ChIP實驗結(jié)果顯示，E2F1與含有BS2的擴增片段結(jié)合，而順鉑的處理又顯著增強了這種結(jié)合能力。這些結(jié)果證明了轉(zhuǎn)錄因子E2F1直接結(jié)合到miR-203基因的啟動子區(qū)的BS2位點，并在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)miR-203的表達水平。
　　2.miR-203對食管鱗癌細胞生物學功能的影響
　　2.1、通過qRT-PCR和CCK8技術(shù)檢測miR-2

9、03在食管鱗癌細胞中的表達以及miR-203對食管鱗癌細胞增殖的影響。通過對四種食管鱗癌細胞株中miR-203的基礎表達水平進行檢測，我們發(fā)現(xiàn)miR-203在EC109細胞中表達最低，在EC9706細胞中表達最高，過表達miR-203 mimics對EC109細胞生長具有顯著的抑制作用。
　　2.2、通過流式細胞技術(shù)和AnnexinⅤ-FITC技術(shù)檢測miR-203對食管鱗癌細胞周期以及細胞凋亡的作用。我們發(fā)現(xiàn)與對照NC相比，在E

10、C109細胞中過表達miR-203能夠誘導細胞在G1期的顯著聚集，與此同時S期細胞比例顯著降低。相反，在EC9706細胞中阻斷miR-203的表達后，G1期細胞的比例顯著降低，而G2/M期和S期細胞顯著增加。結(jié)果提示miR-203可以抑制細胞周期G1/S期周期轉(zhuǎn)換。此外，我們發(fā)現(xiàn)miR-203對食管鱗癌細胞凋亡沒有影響。說明miR-203對食管鱗癌生長的抑制作用是通過調(diào)控細胞周期而非細胞凋亡實現(xiàn)的。
　　2.3、通過Western

11、 blot技術(shù)檢測在食管鱗癌細胞EC109或者Kyse450中過表達miR-203mimics后CDK6、pRb和E2F1的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-203抑制了食管鱗癌細胞中CDK6、pRb和E2F1蛋白的表達。結(jié)果提示可能miR-203通過抑制CDK6的表達作用于pRb蛋白，并最終使E2F1的表達降低。因此，食管鱗癌細胞中miR-203與E2F1之間可能通過CDK6形成了一個負反饋調(diào)節(jié)的環(huán)路。
　　3.順鉑對食管鱗癌細胞中m

12、iR-26b的誘導作用依賴于E2F1的表達
　　3.1、通過qRT-PCR技術(shù)檢測采用不同濃度或者不同時間點的順鉑處理食管鱗癌細胞后，miR-26b的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑處理食管鱗癌細胞EC109和Kyse450后，miR-26b的表達升高，同時順鉑對miR-26b的誘導表達具有時間效應和濃度梯度效應。結(jié)合之前的結(jié)果——順鉑誘導EC109和Kyse450細胞中E2F1和γ-H2X的表達，提示miR-26b在順鉑誘導的食管鱗癌細胞

13、DNA損傷反應中表達增加，而這種表達效應可能與E2F1的表達相關(guān)。
　　3.2、采用定量RT-PCR技術(shù)檢測在食管鱗癌細胞中過表達E2F1后miR-26b的表達;干擾食管鱗癌細胞中E2F1的表達后，加順鉑處理，檢測miR-26b的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌細胞EC109和Kyse450中過表達E2F1后，miR-26b的表達升高;干擾這兩種細胞中E2F1的表達后，阻斷了順鉑對miR-26b的誘導作用。結(jié)果提示在食管鱗癌細胞中順鉑對m

14、iR-26b的誘導作用是由E2F1介導的。
　　4.miR-26b對食管鱗癌細胞生物學功能的影響
　　4.1、通過定量RT-PCR技術(shù)檢測miR-26b在33例食管鱗癌組織及其鄰近正常組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-26b在33例食管鱗癌組織中的表達顯著低于臨近正常組織。
　　4.2、通過CCK8和流式細胞技術(shù)檢測miR-26b對食管鱗癌細胞生長和細胞周期的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-26b可以顯著抑制食管鱗癌EC109

15、細胞的生長。在EC109細胞中過表達miR-26b能夠誘導細胞在G1期的顯著聚集，相反在EC9706細胞中阻斷miR-26b的表達后，G1期細胞的比例顯著降低，結(jié)果提示miR-26b可以誘導食管鱗癌細胞周期G1/S期細胞阻滯。
　　4.3、運用流式細胞技術(shù)檢測不同時間點順鉑處理食管鱗癌細胞后，細胞周期的變化;阻斷食管鱗癌細胞中miR-26b的表達后，對順鉑誘導的細胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別在不同時間點采用順鉑處理食管鱗癌細胞Ky

16、se450后，G1期細胞比例都顯著增加，S期細胞比例顯著降低，而G2期細胞幾乎沒有變化。在Kyse450細胞中阻斷miR-26b的表達后，再加順鉑處理，G1期細胞比例沒有增加，反而降低。結(jié)果提示順鉑能夠誘導食管鱗癌細胞周期G1/S期阻滯，而這種作用依賴于miR-26b的表達。
　　4.4、采用Western blot技術(shù)檢測食管鱗癌細胞中過表達miR-26b后，Rb、ATM及E2F1的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌細胞中過表達miR

17、-26b可以抑制ATM、Rb和E2F1的表達。結(jié)果提示ATM和Rb可能是miR-26b的靶基因，同時miR-26b可能通過Rb或者ATM作用于E2F1的表達，形成了一個負反饋調(diào)節(jié)通路。
　　綜上所述，我們的研究結(jié)果顯示在食管鱗癌細胞中E2F1能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-203和miR-26b的表達，反過來，miR-203和miR-26b又分別通過不同的下游基因反作用于E2F1，提示miR-203和miR-26b為E2F1調(diào)控網(wǎng)絡的新成員。