細胞轉錄因子E2F1對下游基因的調(diào)控及其生物學功能研究.pdf

1、細胞內(nèi)重要的轉錄因子E2F1是E2F家族中第一個被克隆出來的蛋白,對細胞的增殖、分化和凋亡都發(fā)揮著關鍵性的作用。E2F1參與了細胞周期從G1期到S期的轉換:在細胞周期G1期前,Rb與E2F1結合限制了其活性,當細胞周期蛋白激酶CDK結合蛋白Rb后,磷酸化的Rb釋放E2F1/DP-1復合物,這樣E2F1/DP-1就結合到基因組上,發(fā)揮轉錄調(diào)控功能激活下游基因,進而使細胞周期從G1期轉換到S期。同時,E2F1還發(fā)揮促凋亡功能,通過p53依賴

2、型以及p53非依賴型兩種細胞信號通路,進而激活下游促凋亡蛋白如:Bcl-2 homology3(BH3)-only proteins PUMA,Noxa,Bim,Hrk/DP5,Bik以及Caspase-3,-9等;此外,E2F1還抑制細胞存活信號通路分子如:NF-κB,Mcl-1等。通過E2F1這兩方面的作用,最終帶來細胞的凋亡。因此,轉錄因子E2F1與腫瘤的治療有很密切的關系,以E2F1作為腫瘤藥物靶點的研究顯得尤為重要。
　

3、　 由于轉錄因子E2F1在細胞周期和細胞凋亡中發(fā)揮著關鍵性的作用,為了研究E2F1對其下游基因的調(diào)控,本論文利用穩(wěn)定表達ER-E2F1即雌激素受體與E2F1的融合蛋白的H1299細胞株進行研究。該細胞株能夠穩(wěn)定表達大量融合蛋白ER-E2F1,這樣細胞內(nèi)這些融合蛋白就會與細胞膜上的大量配體相結合,從而將ER-E2F1固定在細胞核之外。當加入雌激素受體抑制劑(4-OHT)處理一段時間后,ER-E2F1與細胞膜上的配體的結合就會被打斷,大量

4、的ER-E2F1就會進入細胞核內(nèi)發(fā)揮E2F1的轉錄調(diào)控功能。本論文首先是建立并通過G418篩選出穩(wěn)定表達HA-ER-E2F1融合蛋白的H1299細胞株;其次,在雌激素受體抑制劑(4-OHT)處理的情況下,通過western blot技術檢測發(fā)現(xiàn)E2F1能夠在蛋白水平上激活下游蛋白DP-1和B-Raf;再次,用細胞株H1299和Hela,在瞬時轉染質(zhì)粒HA-E2F1的情況下,通過western blot技術和免疫熒光染色技術分別證實E2F

5、1在蛋白水平上激活下游蛋白DP-1和B-Raf;最后,利用H1299細胞株,在瞬時轉染質(zhì)粒HA-E2F1的情況下,通過Rt-PCR技術檢測發(fā)現(xiàn),E2F1在轉錄水平上激活DP-1.
　　 在本論文所建立的E2F1對其下游基因調(diào)控的穩(wěn)定表達系統(tǒng)中,融合蛋白ER-E2F1在細胞內(nèi)是大量表達的,我們只是通過雌激素受體抑制劑(4-OHT)來改變該蛋白的細胞空間定位,進而在人為可控的情況下來研究E2F1對其下游基因的調(diào)控。我們的結果第一次揭