KLF4表達調(diào)控機制及其生物學功能研究.pdf

1、KLF4(Kruppel-likefactor4)是在1996年被發(fā)現(xiàn)的一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，它是Spl/Kmppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，該家族是機體內(nèi)一類具有重要功能的蛋白質(zhì)，它們參與調(diào)控細胞增殖、分化、胚胎發(fā)育等重要生命過程，并與腫瘤等多種疾病有關(guān)17。由于KLF4在不同的細胞背景下顯示出截然不同的功能，因此備受人們關(guān)注。
　　 在探討DNA損傷后KLF4表達水平的變化時，我們意外地發(fā)現(xiàn)KLF4表達水平與DNA損傷程度

2、呈明顯的負相關(guān)：在輕度可修復的DNA損傷時，KLF4表達顯著上調(diào)；而在重度不可修復的DNA損傷時，KLF4表達明顯下調(diào)。進一步研究KLF4在重度不可修復的DNA損傷時表達下調(diào)的具體機制，我們發(fā)現(xiàn)KLF4表達下調(diào)不是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，而是由于其mRNA穩(wěn)定性降低所致；對KLF4mRNA的3’UTR進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)其含有多個非常保守的HuR結(jié)合序列；通過免疫沉淀實驗，我們證實了HuR在細胞內(nèi)可與KLF4mRNA特異結(jié)合；干擾細胞中Hu

3、R的表達導致KLF4mRNA報告基因活性水平明顯下調(diào)，表明HuR的結(jié)合可以增加KLF4mRNA的穩(wěn)定性；重度不可修復的DNA損傷時HuR和KLF4mRNA的結(jié)合明顯減少，干擾HuR能引起KLF43’UTR報告基因活性對重度DNA損傷的反應(yīng)性明顯降低，表明HuR介導了重度DNA損傷所誘導的KLF4表達水平下調(diào)。
　　 為了進一步研究KLF4基因在DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)中的生物學功能，我們通過人為升高和降低KLF4的表達，觀察KLF4表

4、達水平改變是否影響細胞對DNA損傷的應(yīng)激反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，阻止嚴重DNA損傷時KLF4表達的下調(diào)能抑制p53介導的細胞凋亡，而抑制溫和DNA損傷時KLF4的誘導能促使細胞從周期阻滯走向凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)：阻止嚴重DNA損傷時KLF4表達的下調(diào)，P53對其凋亡促進靶基因Bax的激活明顯減少，而對其細胞周期抑制靶基因p21的激活卻明顯增加；抑制溫和DNA損傷時KLF4的誘導，P53對p21的激活明顯減少，而對Bax基因的激活卻明顯增加。我們

5、的研究結(jié)果表明，在細胞DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)中KLF4表達受到嚴密的控制，其表達水平和DNA損傷程度明顯負相關(guān)：當細胞經(jīng)受輕度的DNA損傷時，KLF4被p53所轉(zhuǎn)錄激活，其通過與p53相互作用促進p53轉(zhuǎn)錄激活細胞周期抑制靶基因p21，從而誘導細胞周期阻滯；當細胞經(jīng)受嚴重DNA損傷時，KLF4mRNA穩(wěn)定性下降，導致KLF4表達的下調(diào)，其表達的下調(diào)促使p53對凋亡靶基因Bax的轉(zhuǎn)錄激活，從而導致細胞凋亡。這一結(jié)果提示KLF4可能在DNA損傷

6、時P53介導細胞“生死”抉擇中擔任重要的角色。我們的研究結(jié)果有助于進一步了解一些攜帶P53野生型的腫瘤細胞對化療藥的耐藥機制。
　　 在論文的第二部分，我們發(fā)現(xiàn)PPARγ激動劑可以快速誘導KLF4表達水平的增加，并且該誘導作用具有PPARγ依賴性。進一步研究發(fā)現(xiàn)PPARγ激動劑對KLF4表達的誘導不被蛋白合成抑制劑放線菌酮所抑制，并且該誘導作用與轉(zhuǎn)錄水平后的調(diào)控無關(guān)，這些信息提示KLF4可能是直接受PPARγ轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因。通

7、過對KLF4啟動子區(qū)序列進行生物信息學分析，我們發(fā)現(xiàn)在KLF4基因的啟動子上含有1個保守的PPAR反應(yīng)元件。ChIP和EMSA實驗證實了PPARγ可以特異地與該位點相互作用，啟動子報告基因的分析結(jié)果顯示PPARγ可以特異地通過該反應(yīng)元件而活化KLF4的轉(zhuǎn)錄表達。我們的研究結(jié)果充分證明了KLF4是一個直接受PPARγ蛋白調(diào)控的下游靶基因。
　　 為了研究KLF4在PPARγ信號轉(zhuǎn)導通路中的功能，我們利用KLF4穩(wěn)定干擾的HCT11

8、6細胞系進行研究。我們發(fā)現(xiàn)在HCT116細胞中干擾KLF4的表達可以明顯抑制PPARγ激動劑引起細胞G1/S期阻滯，提示KLF4在由PPARγ介導的細胞周期抑制過程中發(fā)揮重要的作用。另外，在HCT116細胞中，雖然單獨的PPARγ激動劑誘導細胞凋亡作用并不明顯，但干擾KLF4的表達可以明顯增強激動劑誘導細胞凋亡，表明抑制KLF4的表達能增強HCT116細胞對PPARγ激動劑的敏感性。本研究第一次從分子水平證明KLF4是一個直接受PPAR