KLF4表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、KLF4(Kruppel-likefactor4)是在1996年被發(fā)現(xiàn)的一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，它是Spl/Kmppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，該家族是機(jī)體內(nèi)一類(lèi)具有重要功能的蛋白質(zhì)，它們參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育等重要生命過(guò)程，并與腫瘤等多種疾病有關(guān)17。由于KLF4在不同的細(xì)胞背景下顯示出截然不同的功能，因此備受人們關(guān)注。
　　 在探討DNA損傷后KLF4表達(dá)水平的變化時(shí)，我們意外地發(fā)現(xiàn)KLF4表達(dá)水平與DNA損傷程度

2、呈明顯的負(fù)相關(guān)：在輕度可修復(fù)的DNA損傷時(shí)，KLF4表達(dá)顯著上調(diào)；而在重度不可修復(fù)的DNA損傷時(shí)，KLF4表達(dá)明顯下調(diào)。進(jìn)一步研究KLF4在重度不可修復(fù)的DNA損傷時(shí)表達(dá)下調(diào)的具體機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)KLF4表達(dá)下調(diào)不是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，而是由于其mRNA穩(wěn)定性降低所致；對(duì)KLF4mRNA的3’UTR進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其含有多個(gè)非常保守的HuR結(jié)合序列；通過(guò)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了HuR在細(xì)胞內(nèi)可與KLF4mRNA特異結(jié)合；干擾細(xì)胞中Hu

3、R的表達(dá)導(dǎo)致KLF4mRNA報(bào)告基因活性水平明顯下調(diào)，表明HuR的結(jié)合可以增加KLF4mRNA的穩(wěn)定性；重度不可修復(fù)的DNA損傷時(shí)HuR和KLF4mRNA的結(jié)合明顯減少，干擾HuR能引起KLF43’UTR報(bào)告基因活性對(duì)重度DNA損傷的反應(yīng)性明顯降低，表明HuR介導(dǎo)了重度DNA損傷所誘導(dǎo)的KLF4表達(dá)水平下調(diào)。
　　 為了進(jìn)一步研究KLF4基因在DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)中的生物學(xué)功能，我們通過(guò)人為升高和降低KLF4的表達(dá)，觀(guān)察KLF4表

4、達(dá)水平改變是否影響細(xì)胞對(duì)DNA損傷的應(yīng)激反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，阻止嚴(yán)重DNA損傷時(shí)KLF4表達(dá)的下調(diào)能抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而抑制溫和DNA損傷時(shí)KLF4的誘導(dǎo)能促使細(xì)胞從周期阻滯走向凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：阻止嚴(yán)重DNA損傷時(shí)KLF4表達(dá)的下調(diào)，P53對(duì)其凋亡促進(jìn)靶基因Bax的激活明顯減少，而對(duì)其細(xì)胞周期抑制靶基因p21的激活卻明顯增加；抑制溫和DNA損傷時(shí)KLF4的誘導(dǎo)，P53對(duì)p21的激活明顯減少，而對(duì)Bax基因的激活卻明顯增加。我們

5、的研究結(jié)果表明，在細(xì)胞DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)中KLF4表達(dá)受到嚴(yán)密的控制，其表達(dá)水平和DNA損傷程度明顯負(fù)相關(guān)：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受輕度的DNA損傷時(shí)，KLF4被p53所轉(zhuǎn)錄激活，其通過(guò)與p53相互作用促進(jìn)p53轉(zhuǎn)錄激活細(xì)胞周期抑制靶基因p21，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯；當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受?chē)?yán)重DNA損傷時(shí)，KLF4mRNA穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致KLF4表達(dá)的下調(diào)，其表達(dá)的下調(diào)促使p53對(duì)凋亡靶基因Bax的轉(zhuǎn)錄激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果提示KLF4可能在DNA損傷

6、時(shí)P53介導(dǎo)細(xì)胞“生死”抉擇中擔(dān)任重要的角色。我們的研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解一些攜帶P53野生型的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的耐藥機(jī)制。
　　 在論文的第二部分，我們發(fā)現(xiàn)PPARγ激動(dòng)劑可以快速誘導(dǎo)KLF4表達(dá)水平的增加，并且該誘導(dǎo)作用具有PPARγ依賴(lài)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PPARγ激動(dòng)劑對(duì)KLF4表達(dá)的誘導(dǎo)不被蛋白合成抑制劑放線(xiàn)菌酮所抑制，并且該誘導(dǎo)作用與轉(zhuǎn)錄水平后的調(diào)控?zé)o關(guān)，這些信息提示KLF4可能是直接受PPARγ轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因。通

7、過(guò)對(duì)KLF4啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)在KLF4基因的啟動(dòng)子上含有1個(gè)保守的PPAR反應(yīng)元件。ChIP和EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PPARγ可以特異地與該位點(diǎn)相互作用，啟動(dòng)子報(bào)告基因的分析結(jié)果顯示PPARγ可以特異地通過(guò)該反應(yīng)元件而活化KLF4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。我們的研究結(jié)果充分證明了KLF4是一個(gè)直接受PPARγ蛋白調(diào)控的下游靶基因。
　　 為了研究KLF4在PPARγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的功能，我們利用KLF4穩(wěn)定干擾的HCT11

8、6細(xì)胞系進(jìn)行研究。我們發(fā)現(xiàn)在HCT116細(xì)胞中干擾KLF4的表達(dá)可以明顯抑制PPARγ激動(dòng)劑引起細(xì)胞G1/S期阻滯，提示KLF4在由PPARγ介導(dǎo)的細(xì)胞周期抑制過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。另外，在HCT116細(xì)胞中，雖然單獨(dú)的PPARγ激動(dòng)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用并不明顯，但干擾KLF4的表達(dá)可以明顯增強(qiáng)激動(dòng)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明抑制KLF4的表達(dá)能增強(qiáng)HCT116細(xì)胞對(duì)PPARγ激動(dòng)劑的敏感性。本研究第一次從分子水平證明KLF4是一個(gè)直接受PPAR