KLF4調(diào)控EPCs分化及修復(fù)損傷血管的作用研究-.pdf

1、1．背景與目的：
　　 內(nèi)皮功能紊亂是血管性疾病的重要的病理生理基礎(chǔ)[1,2]，再血管化內(nèi)皮和再內(nèi)皮化是介入治療和藥物支架后阻止再狹窄和血栓形成的重要環(huán)節(jié)[3,4]。大量的證據(jù)表明，骨髓源內(nèi)皮前體細(xì)胞(endotheliAlprecusor cells, EPCs)在血管內(nèi)皮修復(fù)和內(nèi)皮功能替代上起了重要的作用[4,5]。更進(jìn)一步研究表明，EPCs的增殖與分化是影響內(nèi)皮修復(fù)的重要環(huán)節(jié)[6-8]， EPCs在體內(nèi)能夠分化成有功能的內(nèi)

2、皮細(xì)胞，參與缺血組織的血管新生并整合到損傷血管壁的新生內(nèi)膜中參與損傷血管的再內(nèi)皮化[9-12]。但是，EPCs的歸巢、增殖、分化，其受多種因素影響[13]，其內(nèi)在調(diào)控因素尚不完全清楚。
　　 轉(zhuǎn)錄因子KLF4通過(guò)對(duì)其下游基因的調(diào)控,在細(xì)胞增殖、分化、血管生成和腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生理、病理過(guò)程中起著重要作用。近幾年，研究表明KLF4 調(diào)控多種細(xì)胞的增殖分化，可能是調(diào)節(jié)血管功能和疾病的重要“分子開關(guān)”。KLF4 最早發(fā)現(xiàn)于內(nèi)臟和上皮

3、[14-16]，具有促進(jìn)細(xì)胞終端分化、成長(zhǎng)、循環(huán)的功能。其為血流及炎癥因子激活，KLF4 高表達(dá)能夠上調(diào)eNOS、TM，具有抗炎、抗血栓作用[17-19]。
　　 在本研究我們主要通過(guò)構(gòu)建攜帶KLF4基因的腺病毒載體，過(guò)表達(dá)KLF4 或小RNA干擾轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，闡明KLF4在EPCs分化及修復(fù)損傷血管中的作用及其機(jī)制，期望為深入認(rèn)識(shí)KLF4的生物學(xué)功能及EPCs的調(diào)控機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步促進(jìn)血管損傷后內(nèi)皮再生、血管良性修復(fù)

4、提供新的策略和靶點(diǎn)。
　　 2．方法：
　　 2.1KLF4在EPCs分化中的表達(dá)通過(guò)密度梯度離心及選擇性培養(yǎng)的方法在體外分離、培養(yǎng)大鼠骨髓源EPCs，經(jīng)過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、表面分子標(biāo)志以及Dil-acLDL/FITC-UEA-I 雙陽(yáng)性鑒定后，通過(guò)RT-PCR以及Western blot分別觀察KLF4在EPCs分化過(guò)程中mRNA和蛋白表達(dá)水平的表達(dá)。
　　 2.2 重組腺病毒Ad-KLF4的構(gòu)建從大鼠組織提取RNA

5、，經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增得到目的基因KLF4 片段，首先構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pTOPO-KLF4。將pTOPO-KLF4與腺病毒載pAd在重組酶的作用下，pTOPO-KLF4的attL1-attL2 序列與腺病毒載體的attR1-attR2 序列發(fā)生同源重組。重組子命名為pAd-KLF4。pAd-KLF4和空載體pAd 經(jīng)PacI 酶切線性化，暴露出載體的反向終末重復(fù)序列，將重組子轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝，擴(kuò)增后進(jìn)行滴度的測(cè)定。
　　

6、2.3 KLF4在EPCs分化中的作用在EPCs通過(guò)Ad-KLF4 過(guò)表達(dá)或siRNA 沉默KLF4 觀察EPCs分化的表型改變，通過(guò)免疫熒光、流式細(xì)胞學(xué)、RT-PCR 以及Western blot分別觀察成熟血管內(nèi)皮表型CD31、VWF在EPCs分化過(guò)程中免疫熒光、mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　 2.4 KLF4在EPCs分化中的分子機(jī)制在EPCs通過(guò)Ad-KLF4 過(guò)表達(dá)或siRNA 沉默KLF4對(duì)下游靶基因eNOS的在轉(zhuǎn)

7、錄、蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步觀察了eNOS 抑制劑L-NAME，對(duì)Ad-KLF4 誘導(dǎo)的EPCs分化的影響，以明確eNOS是否參與Ad-KLF4 介導(dǎo)調(diào)控的EPCs分化。
　　 2.5 Ad-KLF4 轉(zhuǎn)染的EPCs與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)平滑肌的增殖及遷移的影響培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，將Ad-KLF4 轉(zhuǎn)染的EPCs 接種于下室，分別將平滑肌細(xì)胞接種于上室，建立細(xì)胞共培養(yǎng)體系，通過(guò)3H-TdR 參入法檢測(cè)平滑肌細(xì)胞的增

8、殖作用，用遷移計(jì)數(shù)方法檢測(cè)平滑肌細(xì)胞。
　　 2.6 轉(zhuǎn)染KLF4基因的EPCs 移植在血管內(nèi)膜修復(fù)中的作用建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，將Ad-KLF4 轉(zhuǎn)染的EPCs通過(guò)尾靜脈移植至大鼠體內(nèi)。2周后在局部血管，通過(guò)熒光定量RT-PCR 以及Western blot分別觀察KLF4在血管損傷修復(fù)過(guò)程中mRNA和蛋白表達(dá)，行HE 染色、伊文氏藍(lán)染色計(jì)算內(nèi)膜/中膜面積比及損傷血管再內(nèi)皮化情況。
　　 3．結(jié)論：
　　

9、 4.1在EPCs分化過(guò)程中KLF4在分化晚期表達(dá)，逐漸增高。
　　 4.2 過(guò)表達(dá)KLF4 促進(jìn)EPCs 向成熟內(nèi)皮分化。
　　 4.3 過(guò)表達(dá)KLF4 促進(jìn)EPCs的eNOS表達(dá)，培養(yǎng)液的NO 增多，eNOS 抑制劑，L-NAME 減低了KLF4在EPCs分化為成熟內(nèi)皮表型CD31、VWF的蛋白表達(dá)，抑制了血管新生。
　　 4.4 KLF4基因修飾EPCs與平滑肌共培養(yǎng)明顯抑制平滑肌的增殖和遷移，同時(shí)使平滑肌