Kruppel樣因子4基因klf4在大鼠肝再生中作用研究.pdf

1、klf4作為誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子已成為研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育等生命過程中均發(fā)揮重要作用。
　　 為了探討klf4過量或降低表達(dá)對(duì)肝臟再生的作用，本文以大鼠再生肝為材料，參照klf4的mRNA序列信息設(shè)計(jì)克隆引物和帶酶切位點(diǎn)引物，采用分子克隆技術(shù)得到klf4的克隆載體，測序證實(shí)正確后，以其為模板，進(jìn)一步將基因克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1上，構(gòu)建出表達(dá)載體pEGFP-N1-klf4;另外，同樣參照

2、klf4的mRNA序列信息，利用銳博、Genesil、Ambion和QIAGEN等網(wǎng)站的在線設(shè)計(jì)工具，查閱siRNA設(shè)計(jì)相關(guān)論文，針對(duì)klf4mRNA的2個(gè)區(qū)域合成寡聚核苷酸片段連接到干涉載體pGenesil-1.0上，構(gòu)建出2個(gè)干涉klf4mRNA的干涉載體pGenesil-1.0-k814和pGenesil-1.0-k1082;同樣，雙酶切表達(dá)載體pEGFP-N1-klf4得到klf4的ORF，將其連接到干涉載體pGenesil-1

3、.0-k814和pGenesil-1.0-k1082上，構(gòu)建出干涉載體對(duì)應(yīng)的檢驗(yàn)載體pGenesil-1.0-k814-klf4和pGenesil-1.0-k1082-klf4。測序證實(shí)正確后，將klf4構(gòu)建到干涉載體中，完成干涉載體對(duì)應(yīng)檢驗(yàn)載體pGenesil-1.0-k814-klf4和pGenesil-1.0-k1082-klf4的構(gòu)建；利用構(gòu)建的klf4的表達(dá)載體、干涉載體和檢驗(yàn)載體，采用尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因法，分別將構(gòu)建的3組載體

4、注入大鼠體內(nèi)，熒光顯微技術(shù)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和常規(guī)組織學(xué)技術(shù)檢測轉(zhuǎn)klf4后大鼠死亡率、肝指數(shù)和肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。
　　 經(jīng)測序和電泳檢測證實(shí)，本論文成功構(gòu)建了klf4的表達(dá)載體、干涉載體和檢驗(yàn)載體。運(yùn)用尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因法進(jìn)行klf4基因添加或RNA干涉研究klf4在大鼠肝再生中作用發(fā)現(xiàn)，目的質(zhì)粒的肝內(nèi)表達(dá)動(dòng)力學(xué)與載體作用檢測結(jié)果一致，說明目的片段成功表達(dá)。轉(zhuǎn)入pEGFP-N1-klf4質(zhì)粒后大鼠死亡率正常，肝指數(shù)在120h略有升