胃癌細(xì)胞中KLF4基因的表達(dá)及KLF4基因啟動(dòng)子區(qū)的生物信息學(xué)分析.pdf

1、目的：Kruppel樣因子4（Kruppel-like factor4，KLF4）與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，在不同環(huán)境下其對(duì)腫瘤具有雙重調(diào)節(jié)功能，KLF4基因既可以抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程又可以激活轉(zhuǎn)錄的發(fā)生，在腫瘤中既可以作為促癌因子又可能是抑癌因子。相應(yīng)的，KLF4在不同腫瘤中的表達(dá)存在多樣性，或發(fā)揮癌基因作用，或具備抑癌基因作用。在本研究中我們擬檢測(cè)KLF4在人胃癌細(xì)胞系MKN-45及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1中的表達(dá)情況，并結(jié)合

2、KLF4基因啟動(dòng)子區(qū)的生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)胃癌發(fā)生過(guò)程中可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，為深入研究其轉(zhuǎn)錄-調(diào)控機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。
　　方法:選擇人胃癌細(xì)胞株MKN-45及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1，提取細(xì)胞株RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)以上兩種細(xì)胞中的KLF4 mRNA表達(dá)水平；運(yùn)用生物信息學(xué)方法獲取KLF4基因基本信息、啟動(dòng)子序列ID，為克服單個(gè)軟件的局限性，分別通過(guò)PromotorScan、Patch

3、、P-Match、AliBaba2在線預(yù)測(cè)軟件分析人KLF4基因啟動(dòng)子序列，預(yù)測(cè)人KLF4基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，最后利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)獲取胃癌組織中異常表達(dá)的蛋白，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)果篩選出人胃癌KLF4基因可能涉及的轉(zhuǎn)錄因子。
　　結(jié)果：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：KLF4 mRNA在人胃癌細(xì)胞株MKN-45中的表達(dá)低于人正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1中的表達(dá)（4.24±0.15 vs6.66±0.23），差異具

4、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。通過(guò)對(duì)KLF4基因啟動(dòng)子區(qū)域的生物信息學(xué)分析，獲得人KLF4基因ID：9314，定位于9q31，全長(zhǎng)4915 bp，其mRNA ID：NM_004235.4，該基因啟動(dòng)子ID：HPRM23684，全長(zhǎng)1319 bp。各軟件分析KLF4啟動(dòng)子序列，其中PromotorScan獲得57個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，涉及17個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括ATF、EGR-1、GCF、H4TF1、MLTF、MT-I.6、Sp1等。Patch

5、獲得562個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，涉及113個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括AP-1、H4TF1、LEF-1、NF-1、Pax-5、SRF、SMAD-4等。P-Match參數(shù)設(shè)置為“減少錯(cuò)誤率”時(shí)，獲得18個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，涉及9個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括AP-4、ARP-1、ATF、NF-E2等；參數(shù)設(shè)置為“減少假陰性”時(shí)，獲得295個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，涉及25個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括AP-4、ATF、CREB、NF-1、NF-E2、YY1等。AliBaba2獲得172

6、個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，涉及52個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括AP-2、ATF、NF-1、Sp1、USF、YY1等。以上四種軟件結(jié)果經(jīng)匯總?cè)ブ?，共涉?83個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。另外，通過(guò)在線基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得胃癌中異常表達(dá)的蛋白共3249個(gè)，與上述183個(gè)轉(zhuǎn)錄因子作對(duì)比篩查，提示在人胃癌中可能參與KLF4調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子有17個(gè)，包括LEF-1、NF-1、Pax-5、SMAD-4、SRF、YY1等。
　　結(jié)論：本研究檢測(cè)提示在胃癌細(xì)胞MKN-45中KLF