轉(zhuǎn)錄因子Klf4對(duì)小鼠Dppa2基因調(diào)控作用的初步研究.pdf

1、第一部分1例新發(fā)成骨不全的突變鑒定及多態(tài)性篩查
　　 成骨不全( Osteogenesis imperfecta，OI)是一種結(jié)締組織疾病，其特點(diǎn)是不同程度的骨質(zhì)脆弱，常伴隨身材矮小、藍(lán)鞏膜、聽力喪失、牙本質(zhì)發(fā)育不全、韌帶及皮膚高度松弛等。成骨不全在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率約為1/10，000-1/15.000。
　　 Ⅰ型膠原蛋白是機(jī)體纖維膠原的主要組成部分，占據(jù)了哺乳動(dòng)物四分之一的體重。它主要存在于骨骼、骨膜、皮膚、韌帶、

2、血管、鞏膜和角膜組織。若Ⅰ型膠原蛋白中的連續(xù)的三螺旋結(jié)構(gòu)出現(xiàn)缺陷，則導(dǎo)致成骨不全。大多數(shù)成骨不全的病例是由于COL1A1或COL1A1基因發(fā)生突變所導(dǎo)致的，這兩個(gè)基因分別編碼Ⅰ型膠原蛋白的前α-1鏈和前a-2鏈。
　　 為了鑒定一家系中新發(fā)成骨不全病人的基因突變，我們應(yīng)用PCR-DHPLC-DNA測(cè)序的基因診斷策略，發(fā)現(xiàn)在該病人COL1A1基因第36號(hào)外顯子內(nèi)存在一個(gè)雜合突變2461(2461 G＞A)，導(dǎo)致原來(lái)的甘氨酸突變?yōu)榻z

3、氨酸(G821S)。多態(tài)性篩查排除該突變?yōu)槎鄳B(tài)的可能，因此，該突變很可能導(dǎo)致成骨不全。
　　 第二部分轉(zhuǎn)錄因子K1f4對(duì)小鼠Dppa2基因調(diào)控作用的
　　 初步研究
　　 Dppa2(Developmental Pluripotency-Associated gene2)是近幾年發(fā)現(xiàn)的在多能性細(xì)胞及某些癌組織中特異性表達(dá)的基因，與胚胎干細(xì)胞(ESCs)的多能性維持和自我更新有關(guān)，其表達(dá)抑制引起ESCs的分化。K1

4、f4在體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，其在胚胎發(fā)育進(jìn)程中的調(diào)控作用引起世人的廣泛關(guān)注。先前的研究證明Dppa2可能作為Oct4的靶基因參與到ESCs多能性維持和自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中來(lái)。本課題借助生物信息學(xué)分析以小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)為材料，探索轉(zhuǎn)錄因子K1f4的表達(dá)變化對(duì)Dppa2表達(dá)的影響。
　　 通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在Dppa2基因啟動(dòng)子區(qū)存在4個(gè)K1f4的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)Dp

5、pa2作為K1f4的靶基因參與ESCs不分化狀態(tài)的維持和自我更新。
　　 我們首先以mESCs的cDNA為模板，利用PCR獲得K1f4的開放閱讀框(ORF)，并將其克隆入真核細(xì)胞表達(dá)載體pCMV-myc中去，經(jīng)過(guò)PCR、DNA測(cè)序等鑒定構(gòu)建成功。接著我們利用PLKO.1載體構(gòu)建了針對(duì)小鼠K1f4基因的RNA干擾（RNAi）載體，同樣經(jīng)過(guò)測(cè)序證明構(gòu)建成功。
　　 為了鑒定干擾效果，我們向人的293T細(xì)胞（不表達(dá)小鼠K1f4

6、基因）中，分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCMV-myc-K1f4質(zhì)粒，以及共轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒，并以未處理的293T細(xì)胞作為對(duì)照。通過(guò)RT-PCR、Realtime PCR、 Western Blot等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)为?dú)轉(zhuǎn)染K1f4真核表達(dá)質(zhì)粒的293T細(xì)胞中可以檢測(cè)到K1f4的高表達(dá)，而兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)和未處理的293T細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到該基因的表達(dá)，可見K1f4的真核表達(dá)載體、以及針對(duì)小鼠K1f4基因的RNAi載體均可發(fā)揮作用。
　　 最后，我